彭 菁，李 蓓，吳移謀

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所， 湖南 衡陽 421001)

19世紀(jì)50年代,在非洲瘧疾流行區(qū)域,Burkitt發(fā)現(xiàn)少數(shù)兒童患有B細(xì)胞淋巴瘤;在1964年,Epstein、Achong和Barr在培養(yǎng)的Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中觀察到一種皰疹病毒。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)定殖于人的鼻咽部并且在上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，進(jìn)一步感染B淋巴細(xì)胞，而B淋巴細(xì)胞通過血液循環(huán)到各個組織和器官，從而引起全身感染，而這些感染EBV的淋巴細(xì)胞潛伏于人體內(nèi)，當(dāng)自身免疫力低下時會引起一系列的臨床癥狀[1]。在不同的感染時期表達(dá)的抗原不同，如潛伏期感染主要是表達(dá)潛伏膜蛋白和核抗原，而增殖期感染主要表達(dá)EBV膜抗原和EBV衣殼蛋白等。EBV感染具有地方特點(diǎn)，在我國南方廣州及東南亞為鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，而在其它一些地方如兒童初次感染EBV會引起急性淋巴組織增生性疾病也就是傳染性單核細(xì)胞增多癥，其主要的臨床表現(xiàn)為外周血中單核細(xì)胞和異型淋巴細(xì)胞大量增多[2-5]。疫苗是預(yù)防EBV感染最有效的方法，但我國研制的基因重組疫苗正在觀察中。目前對EBV感染尚缺乏肯定療效的抗病毒藥物。阿昔洛韋用藥期間，能減少EBV從咽部排毒，但不能改善傳染性單核細(xì)胞增多癥的癥狀，對免疫缺陷患者中的EBV淋巴瘤治療也無效。

防治EBV最具前景的途徑是EBV疫苗[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)EBV膜蛋白gp350/220抗原作為靶抗原既能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，也能起到體液免疫保護(hù)作用，同時通過研究發(fā)現(xiàn)gp350/220抗原能和細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)[7]，說明該抗原具有T細(xì)胞表位，既能產(chǎn)生體液免疫又能產(chǎn)生細(xì)胞免疫，這樣對EBV的控制起重要作用，這進(jìn)一步說明此抗原靶抗原在誘導(dǎo)特異性體液免疫保護(hù)的同時，還能通過細(xì)胞免疫途徑控制EBV在體內(nèi)的反復(fù)增殖。目前,EBV的預(yù)防性疫苗主要是針對gp350/220的，代表性的葛蘭素史克公司研發(fā)的gp350/AS04疫苗已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn),結(jié)果顯示，該疫苗對預(yù)防由EBV引起的傳染性單核細(xì)胞增多癥的發(fā)生有顯著的抑制作用，但仍未取得預(yù)期的理想效果。因而對EBV gp350/220氨基酸序列中的優(yōu)勢表位進(jìn)行預(yù)測和篩選，將有助于研發(fā)針對EBV的高效價優(yōu)勢表位疫苗。本研究擬以EBV gp350/220氨基酸序列為基礎(chǔ)，利用蛋白序列分析軟件，分析gp350/220的信號肽、二級結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位,尋找T-B聯(lián)合表位,為進(jìn)一步研制高價優(yōu)勢表位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 EBV gp350/220氨基酸序列

EBV gp350/220氨基酸序列檢索來自Gen Bank，來源于B95.8細(xì)胞株，共由291個氨基酸殘基組成，蛋白質(zhì)序列編號為ADN85210.1。

1.2 gp350/220氨基酸序列跨膜序列的分析

運(yùn)用TMHMM Sever2.0軟件對gp350/220氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3 gp350/220抗原二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用SOPMA Sever軟件預(yù)測gp350/220的蛋白二級結(jié)構(gòu)。

1.4 gp350/220抗原B細(xì)胞和T細(xì)胞表位預(yù)測

運(yùn)用在線預(yù)測網(wǎng)站IEDB等參數(shù)對EBV gp350/220抗原的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，運(yùn)用SYFPEITHI在線預(yù)測對EBV gp350/220抗原的T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。

1.5 EBV gp350/220抗原T-B聯(lián)合表位的篩選

運(yùn)用DNA man軟件比對篩選出EBV gp350/220抗原T-B聯(lián)合表位。

2 結(jié) 果

2.1 查找Gen bank EBV gp350/220抗原的氨基酸序列

gp350/220抗原共有291個氨基酸殘基編碼,序列為：getspqanttnhtlggtsstpvvtsppknatsavttgqhnitssst

ssmslrpssisetlspstsdnstshmplltsahptggenitqvtpaststhhvsts

spaprpgttsqasgpgnsststkpgevnvtkgtppknatspqapsgqktavp

tvtstggkansttggkhttghgartstepttdyggdsttprtrynattylppstsse

lrprwtftsppvttaqatvpvpptsqprfsnlsmlvlqwaslavltlllllvmadc

afrrnlstshtyttppyddaetyv。

2.2 運(yùn)用TMHMM Sever2.0對gp350/220的跨膜序列進(jìn)行分析

gp350/220的跨膜區(qū)在247-269位區(qū)域，其中1-246位區(qū)域顯示為膜外區(qū)，270-291為膜內(nèi)區(qū)(圖1)。

圖1 TMHMM分析gp350/220的跨膜結(jié)構(gòu)

2.3 gp350/220抗原蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA Sever對gp350/220抗原進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該抗原柔性結(jié)構(gòu)占氨基酸總數(shù)的87.63%(圖2)。通過對gp350/220抗原的291個氨基酸各參數(shù)預(yù)測的結(jié)果，最終確定gp350/220的潛在B細(xì)胞抗原表位區(qū)域，如表1和圖3。

圖2 SOPMA分析的gp350/220二級結(jié)構(gòu)

表1 運(yùn)用不同方法預(yù)測EBVgp350/220蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

圖3 IEDB分析的gp350/220的B細(xì)胞抗原表位A:Kolaskar & Tongaonkar Antigenicity Prediction Kolaskar & Tongaonkar的抗原性指數(shù)預(yù)測；B:Emini Surface Accessibility Prediction Emini表面可及性指數(shù)預(yù)測；C:Bepipred Linear Epitope Bepipred線性表位預(yù)測；D:Parker Hydrophilicity Prediction Parker親水性指數(shù)預(yù)測；E:Karplus & Schulz Flexibility Prediction Karplus & Schulz 柔韌性區(qū)域預(yù)測

2.4 T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

運(yùn)用SYFPEITHI預(yù)測gp350/220抗原T細(xì)胞表位，在進(jìn)行T細(xì)胞表位的預(yù)測后，選取了分值高的12個T細(xì)胞抗原表位，預(yù)測的結(jié)果見表2。

表2 SYFPEITHI預(yù)測的MHCⅠ類HLAA 0201限制性T細(xì)胞表位

2.5 運(yùn)用DNAman軟件中的多重序列對比T、B細(xì)胞表位

T-B聯(lián)合表位為52-59 92-98 110-115，見表3。

表3 B細(xì)胞與T細(xì)胞的聯(lián)合表位

3 討 論

EBV為DNA病毒，主要感染淋巴細(xì)胞，人是該病毒的宿主，主要通過唾沫傳播，以兒童感染多見，感染之后基本都能產(chǎn)生抗體。EBV包膜上的gp350抗原可以與B淋巴細(xì)胞表面的細(xì)胞因子結(jié)合而感染B淋巴細(xì)胞[8]，這些細(xì)胞大量進(jìn)入血液循環(huán)而造成全身性感染，并可長期潛伏在人體淋巴組織中。

目前預(yù)防EBV感染行之有效的的方法還是使用疫苗預(yù)防為主，一種制備疫苗的新型策略，即基于已知核苷酸或氨基酸序列，利用計(jì)算機(jī)軟件輔助分析，或利用噬菌體展示技術(shù)，確定和篩選可能的優(yōu)勢表位，然后人工合成或借助基因工程技術(shù)而制備含優(yōu)勢表位的多肽疫苗。

目前EBV疫苗的研究主要集中于包膜糖蛋白gp350，研究發(fā)現(xiàn)gp350于CD21結(jié)合而感染細(xì)胞且此蛋白是EBV和被感染細(xì)胞上最多的糖蛋白，同時能通過體液免疫產(chǎn)生抗體來預(yù)防EBV感染。李文姝等[9-12]制備了gp350重組疫苗應(yīng)于臨床研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該疫苗有效保護(hù)率能夠達(dá)到78%左右，同時能夠產(chǎn)生EBV抗體且抗體在體內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用時間可以長達(dá)18個月左右，說明此疫苗具有良好的抗原性和免疫原性。

近幾年來新興起來的一種重要的疫苗即重組表位疫苗[13]。本研究通過以gp350抗原的優(yōu)勢表位構(gòu)建表位疫苗，其中包括B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，B細(xì)胞表位(決定簇)，是由抗原表面的親水性氨基酸組成，易于接近B細(xì)胞受體(BCR)和抗體分子并被識別，一般由3～5個在空間上相鄰的、連續(xù)的或者不連續(xù)的氨基酸殘基組成。前者稱線性表位或連續(xù)表位，后者為肽鏈折疊后形成，稱為構(gòu)象表位或者不連續(xù)表位。T細(xì)胞表位指被T細(xì)胞受體(T-cell receptor/TCR)識別的抗原表位，表位成分為蛋白質(zhì)降解后的多肽，多存在于抗原分子內(nèi)部，需要經(jīng)過抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells/APC)加工后與MHC分子結(jié)合成為復(fù)合物才能被TCR識別。機(jī)體的免疫應(yīng)答分為細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答中抗原分子表面的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位分別被B、T細(xì)胞表面的BCR和TCR識別，從而誘導(dǎo)出高度特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生特異性的免疫效應(yīng)[14-15]。

本研究通過對gp350蛋白氨基酸序列等參數(shù)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)膜外區(qū)域和柔性區(qū)域占該蛋白的絕大部分區(qū)域，而抗原表位的形成基本在轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)較松散,易扭曲、盤旋并展示在蛋白表面和該蛋白的膜外區(qū)域，從而有利于抗體結(jié)合，為B細(xì)胞表位提供依據(jù)。同時對gp350蛋白的T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，20分以上的T細(xì)胞表位有12個，T細(xì)胞表位，尤其是CTL表位在清除腫瘤和細(xì)胞內(nèi)感染病原體的特異性免疫反應(yīng)中起主要作用，而針對腫瘤抗原或感染靶細(xì)胞特定靶點(diǎn)的B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，則發(fā)揮如中和、調(diào)理和ADCC作用等。因此，理想的疫苗在設(shè)計(jì)上要同時考慮T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。

本研究發(fā)現(xiàn)gp350蛋白的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的3個重疊區(qū)域?yàn)?2-59、92-98、110-115。本研究目的是為開發(fā)具有較強(qiáng)的免疫原性的高效疫苗，作為理想的免疫原，抗原分子中應(yīng)包含目的抗原的B細(xì)胞表位和自身或外源T細(xì)胞表位,可誘導(dǎo)出高度特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時從體液免疫和細(xì)胞免疫水平起到預(yù)防或治療作用，為進(jìn)一步研制高效多價疫苗奠定理論基礎(chǔ)。