王錫攜

(東方市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 東方572600)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是好發(fā)于青壯年的免疫性疾病，發(fā)病高峰年齡為27～29歲，統(tǒng)計(jì)顯示我國患病率約70～100/10萬人，且以每年1.6～10萬的速度增加，男女患者比例約1∶10[1]。SLE發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前普遍認(rèn)為是由機(jī)體免疫功能紊亂所致，常見包括自身抗體形成、補(bǔ)體激活及淋巴細(xì)胞浸潤等，其中遺傳、環(huán)境及性激素水平異常等因素均可能參與SLE發(fā)病和進(jìn)展[2-3]。固有免疫細(xì)胞無需抗原誘導(dǎo)即可識別和殺滅部分異常細(xì)胞，其中自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)為重要組成部分，有研究表明NK細(xì)胞表面CD16+占比為90%，CD56+占比超過95%，而CD3通常表現(xiàn)為陰性，近年來在SLE中的影響逐漸引起關(guān)注[4-5]。SLE隨病情進(jìn)展可累及皮膚、關(guān)節(jié)及血液等多個器官系統(tǒng)，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)為SLE常見并發(fā)癥和致死原因，Lin等[6]報(bào)道顯示NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常包括淋巴細(xì)胞異?；罨庖邚?fù)合物損傷及免疫耐受喪失等多個層面，可能在SLE和LN發(fā)病中占有重要地位。本研究主要對SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞水平進(jìn)行檢測并分析其變化規(guī)律，為明確其在SLE發(fā)病和進(jìn)展中的作用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年8月至2019年8月本院SLE患者94例為研究對象，其中男性15例，女性79例，年齡20～67歲，平均(32.46±5.28)歲，病程2～51個月，平均(13.82±4.05)個月，根據(jù)SLE疾病活動性指數(shù)(SLEDAI)[7]評分將患者分為活動組38例(≥5分)和非活動組56例(<5分)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合SLE相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡≥18歲；③此前6個月內(nèi)未接受免疫調(diào)節(jié)治療；④患者及家屬知情并同意本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并風(fēng)濕性病變；②伴其它免疫性疾??；③伴活動性消化道疾??；④妊娠期或哺乳期患者；⑤伴精神狀態(tài)異常。另選取本院同期健康體檢者50例為對照組，其中男性7例，女性43例，年齡18～65歲，平均(34.09±5.61)歲，兩組年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

患者入院后收集性別、年齡和病程等基本資料，同時進(jìn)行血常規(guī)、尿常規(guī)及肝腎功能等常規(guī)檢查，采用SLEDAI對病情進(jìn)行評估和分級，另采集兩組外周靜脈血3 mL于EDTA-K3抗凝管中，搖勻后室溫保存并采用FACS Aria II流式細(xì)胞儀(美國BD公司)及配套試劑檢測CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞數(shù)量和比例。具體方法如下：取50 μL全血標(biāo)本置于BD Trucount絕對計(jì)數(shù)管并分別標(biāo)記為A管和B管，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×107/mL，然后于A管中加入CD3-FITC、CD45-PerCP、CD4-APC及CD8-PE各20 mL，B管中加入CD3FITC、CD(16+56)-PE、CD45-PerCP級CD19-APC各20 mL，分別混勻后在20～25 ℃環(huán)境下避光反應(yīng)15 min，向兩管分別加入BD Multitest IMK kit溶血素(1×)450 μL，充分搖勻后同上述條件孵育15 min，完成后將樣本上機(jī)檢測并采用Cellquest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，測量其中CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分率。

1.3 觀察指標(biāo)

根據(jù)腎功能檢測結(jié)果判斷腎臟受累情況，將患者分為狼瘡性腎炎(LN)組和非LN組，比較SLE組和對照組、活動組和非活動組及LN組和非LN組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞表達(dá)差異，并分析CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞百分率與SLE患者SLEDAI評分和24 h尿蛋白定量的相關(guān)性，探討CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞百分率評估SLE活動性和LN的準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SLE組和對照組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞表達(dá)比較

SLE組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分率明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 SLE組和對照組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞表達(dá)比較

2.2 活動組和非活動組檢查結(jié)果比較

活動組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分率低于非活動組，SLEDAI評分和24 h尿蛋白定量高于非活動組(P<0.05)。見表2。

表2 活動組和非活動組檢查結(jié)果比較

2.3 LN組和非LN組檢查結(jié)果比較

LN組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分率低于非LN組，SLEDAI評分和24 h尿蛋白定量高于非LN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 LN組和非LN組檢查結(jié)果比較

2.4 CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞與SLEDAI評分和24 h尿蛋白定量的相關(guān)性

Pearson積差分析顯示，CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)與SLEDAI評分呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.251，P=0.015)，與24 h尿蛋白定量呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.253，P=0.014)。見圖1。

圖1 CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞與SLEDAI評分和24 h尿蛋白定量的相關(guān)性

2.5 CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)對SLE活動性和LN的評估價(jià)值

以8.04%為臨界值，CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)判斷SLE活動性的靈敏度為57.78%，特異度為78.57%，AUC為0.677(95%CI：0.572～0.770)；以8.84為臨界值，CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)判斷SLE患者發(fā)生LN的靈敏度為82.76%，特異度為72.31%，AUC為0.834(95%CI：0.743～0.903)。見圖2。

圖2 CD3-CD16+CD56+NK判斷SLE活動性(左)和LN(右)的ROC曲線

3 討 論

SLE患者免疫調(diào)節(jié)紊亂常累及整個免疫系統(tǒng)，如淋巴細(xì)胞異?；罨⒚庖吣褪軉适Ъ把a(bǔ)體缺陷等，隨著對各種自身抗體的深入研究，T、B淋巴細(xì)胞在SLE發(fā)病中的作用現(xiàn)已基本闡明，其中B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體是導(dǎo)致SLE的關(guān)鍵因素，T淋巴細(xì)胞主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，可刺激B細(xì)胞活化、增殖及抗體分泌，同時還參與細(xì)胞免疫[9]。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道[10]NK細(xì)胞與SLE發(fā)病也具有密切聯(lián)系，可見多種淋巴細(xì)胞參與了SLE病程進(jìn)展，觀察外周血NK細(xì)胞水平變化可能有利于進(jìn)一步明確SLE發(fā)病機(jī)制，同時為患者病情評估和臨床診治提供參考依據(jù)。

NK細(xì)胞主要生理功能為自然防御和免疫調(diào)節(jié)，是繼T、B細(xì)胞之后的第三類淋巴細(xì)胞譜系，在外周血單個核細(xì)胞中占比5%～15%，可通過MHC-Ⅰ分子識別并清除靶細(xì)胞，大量研究表明NK細(xì)胞在感染、腫瘤及免疫性疾病中均發(fā)揮重要作用[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道SLE患者外周血NK細(xì)胞絕對值和百分率均明顯減少，推測其原因可能與機(jī)體大量釋放干擾素并誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化和凋亡有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明[13]。本研究對SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞變化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其絕對計(jì)數(shù)和百分率明顯低于對照組，且活動組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分率低于非活動組，分析其原因可能與NK細(xì)胞向靶器官聚集有關(guān)，并進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體對自身抗體抑制作用減弱，這與活動期SLE患者體內(nèi)可檢測到自身抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物明顯增加的結(jié)果相一致[14]，可見NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)在SLE發(fā)病和進(jìn)展中均發(fā)揮重要作用。SLEDAI評分根據(jù)患者癥狀體征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果對病情進(jìn)行客觀判斷，從而為激素和免疫抑制劑選用提供參考依據(jù)，本研究結(jié)果顯示活動組SLEDAI評分高于非活動組，且外周血CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)與SLEDAI評分呈明顯負(fù)相關(guān)性，提示檢測NK細(xì)胞表達(dá)情況也有利于SLE患者病情評估，作ROC曲線分析其判斷SLE病情活動性的價(jià)值顯示AUC為0.677，以8.04%為臨界值時其靈敏度為57.78%，特異度為78.57%，表明檢測外周血CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞對評估SLE病情活動度具有一定參考價(jià)值，但單獨(dú)應(yīng)用時準(zhǔn)確率仍相對偏低，同時活動組24h尿蛋白定量明顯高于非活動組，提示活動期SLE患者腎臟損害更為嚴(yán)重。

SLE隨著病情進(jìn)展可造成多器官結(jié)構(gòu)和功能受損，其中LN是臨床最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病原因可能與免疫復(fù)合物在腎小球?yàn)V過膜沉積和干擾素等細(xì)胞因子表達(dá)水平升高有關(guān)[15-16]。文獻(xiàn)報(bào)道SLE患者腎功能受損程度與淋巴細(xì)胞浸潤關(guān)系密切，CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞在激活后可釋放大量干擾素和細(xì)胞毒顆粒，并可造成腎功能損害[17]。本研究結(jié)果顯示LN組CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分率均明顯低于非LN組，SLEDAI評分和24h尿蛋白定量明顯高于非LN組，采用Pearson積差分析顯示CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)與24h尿蛋白定量具有明顯負(fù)相關(guān)性，表明隨著NK細(xì)胞表達(dá)減少，SLE患者腎功能損害明顯加重，Muskardin等[18]研究發(fā)現(xiàn)在MRL/lpr狼瘡樣小鼠腎臟存在大量NK細(xì)胞活化和干擾素等細(xì)胞因子釋放并造成腎臟組織損傷，且隨著病情嚴(yán)重程度增加，NK細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)明顯減少，推測其原因與細(xì)胞因子誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究作ROC曲線分析CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞計(jì)數(shù)對LN診斷價(jià)值顯示其AUC高達(dá)0.834，以8.84為臨界值時靈敏度為82.76%，特異度為72.31%，可見檢測外周血NK細(xì)胞對判斷SLE患者腎功能損害具有較高參考價(jià)值。本研究不足之處僅觀察了SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞變化，但NK細(xì)胞在適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)中也占有重要地位，且SLE發(fā)病與多種免疫功能異常有關(guān)，因此后續(xù)還需要對NK細(xì)胞于T、B淋巴細(xì)胞，自身抗體以及細(xì)胞因子等的關(guān)系進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步明確NK細(xì)胞在SLE病程中的作用。

綜上所述，SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞表達(dá)明顯減少，觀察其表達(dá)水平變化可為判斷病情活動度和腎功能損害提供參考依據(jù)。