王 剛，姚麗霞，楊 濤，彭克楠，郭留雄，魏 東，谷守義，劉俊江

(河北省人民醫(yī)院 1.泌尿外科,2.老年病二科,3.檢驗(yàn)科,河北 石家莊 050051)

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的腫瘤，病變的發(fā)生與基因和遺傳因素的改變有關(guān)[1]。微小RNA(miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤形成和進(jìn)展有關(guān)的因子，通過(guò)與靶mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合發(fā)揮調(diào)控靶基因的作用[2]。本研究通過(guò)在The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)前列腺癌中miRNAs的差異性表達(dá)進(jìn)行篩選，選擇在前列腺癌中異常表達(dá)明顯、且尚未見(jiàn)報(bào)道的微小RNA-362-3p(miR-362-3p)進(jìn)行研究，并應(yīng)用軟件預(yù)測(cè)下游的靶因子，選擇與miR-362-3p關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的上皮型粘附素(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-11(MMP-11)和基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)作為靶基因，探討其臨床意義及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月至2016年6月確診為前列腺癌的患者67例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理確診為前列腺癌，并符合WHO中的標(biāo)準(zhǔn)；②首診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多原發(fā)癌；②術(shù)前行放、化療。年齡55～86歲，中位年齡67歲。留取術(shù)后的腫瘤組織作為觀察組。同期，選擇前列腺增生的組織67例為對(duì)照組，年齡56～84歲，中位年齡68歲。均留取病變組織的新鮮凍存標(biāo)本(-80 ℃保存)和石蠟包埋組織。二組在年齡的比較中無(wú)明顯差別。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，家屬均簽訂知情同意書(shū)。

1.2 miR-362-3p的檢測(cè)

檢測(cè)前列腺癌和前列腺增生組織中miR-362-3p的表達(dá)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。引物由江蘇楚天生物科技公司合成。上游：5′-GATGACACTGAGGCTGAG-3′，下游：5′-ACGTGCACTTCGTCCGCTT-3′內(nèi)參為U6，上游：5′-GGAACAGAGAAAGATTAGC-3′，下游：5′-TTGGAATTCACG AATTCCG-3′。提取總RNA，cDNAs由TaqMan MicroRNA合成，試劑購(gòu)自江蘇楚天生物科技公司。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共31個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸6 min。60 ℃進(jìn)行信號(hào)采集，記錄Ct值。通過(guò)2-ΔΔCt法表示結(jié)果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-Ct對(duì)照(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct對(duì)照(校正樣品)]。

1.3 免疫組化的檢測(cè)

免疫組化SP法檢測(cè)E-cadherin和MMP-11表達(dá)。簡(jiǎn)略步驟為：石蠟包埋前列腺癌組織，4 μm切片，DAB顯色，以黃色和黃褐色為陽(yáng)性。E-cadherin陽(yáng)性部位是細(xì)胞膜，MMP-11陽(yáng)性部位是細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜，選擇5個(gè)顯色最明顯的400倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性率并取平均值。

1.4 Western Blot法

應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)前列腺癌組織中MMP-14的表達(dá)，以MMP-14與GAPDH比值表示MMP-14的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。相關(guān)分析行Pearson相關(guān)分析。行K-M生存分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組中miR-362-3p表達(dá)

見(jiàn)圖1顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線，如表1所示，miR-362-3p在觀察組中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

(n=67)

2.2 觀察組不同臨床特征分組患者術(shù)后組織中miR-362-3p表達(dá)

MiR-362-3p在脈管癌栓、Gleason分級(jí)、轉(zhuǎn)移和不同TNM分期的表達(dá)中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)，而在不同年齡、神經(jīng)累犯的表達(dá)中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 觀察組中miR-362-3p表達(dá)的生存分析

觀察組均進(jìn)行術(shù)后3年(36月)的隨訪，方式為電話、門(mén)診及家訪等形式，截止時(shí)間點(diǎn)2019年6月30日。其中生存30例，死亡34例，失訪患者3例。死亡患者確診后的生存時(shí)間7～36個(gè)月，生存中位數(shù)為20個(gè)月。生存分析顯示miR-362-3p與生存時(shí)間有關(guān)(χ2=6.31，P=0.001)。見(jiàn)圖2。

2.4 前列腺癌組織miR-362-3p與E-cadherin、MMP-11的相關(guān)性

如圖3A所示，E-cadherin表達(dá)部位是在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，呈棕黃色，E-cadherin在前列腺癌中的陽(yáng)性率范圍3～55%，平均21.4%。相關(guān)分析顯示miR-362-3p與E-cadherin呈正相關(guān)性(r=0.59，P=0.013)(見(jiàn)圖3B)。

圖2 miR-362-3p生存分析圖

圖3 E-cadherin在前列腺癌中表達(dá)及其與-cadherin之間具有相關(guān)性A：E-cadherin在前列腺癌中表達(dá)的免疫組化圖(200×)，B：miR-362-3p與E-cadherin之間具有正相關(guān)的趨勢(shì)散點(diǎn)圖

2.5 前列腺癌組織MMP-11的表達(dá)，及與miR-362-3p相關(guān)性

如圖4A所示，MMP-11表達(dá)部位是在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色，MMP-11在前列腺癌中的陽(yáng)性率范圍10～70%，平均39.0%，相關(guān)分析顯示miR-362-3p與MMP-11呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.50，P=0.019)。見(jiàn)圖4B。

圖4 MMP-11的表達(dá)及其與miR-362-3p相關(guān)性A：MMP-11在前列腺癌中的表達(dá)(400×)；B:miR-362-3p與MMP-11之間的相關(guān)趨勢(shì)散點(diǎn)圖

2.6 前列腺癌中miR-362-3p與MMP-14的相關(guān)性

如圖5所示，Western Blot法檢測(cè)MMP-14在前列腺癌中表達(dá)，結(jié)果顯示，MMP-14在癌組織中的表達(dá)較高，范圍是0.9～3.8，平均2.1。相關(guān)分析顯示miR-362-3p與MMP-14呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.49，P=0.021)(見(jiàn)圖6)。

圖5 MMP-14在前列腺癌中的表達(dá)

圖6 miR-362-3p與MMP-14相關(guān)性的散點(diǎn)圖

3 討 論

前列腺癌病變的機(jī)理與基因和遺傳因素密切相關(guān)[3]，涉及到DNA、RNA及蛋白表達(dá)的異常調(diào)控。miRNAs是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的因子[4]。其作為非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度為18-25核苷酸，由前體miRNA剪切產(chǎn)生，與靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域的特異性因子結(jié)合引起mRNA降解或翻譯的抑制，不僅對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)控，還對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有重要的調(diào)控作用。我們?cè)诨驇?kù)中篩選到miR-362-3p是重要的腺癌調(diào)控因子，其靶基因有40多個(gè)，本研究選擇的靶因子均為轉(zhuǎn)移相關(guān)的[5-6]。E-cadherin是細(xì)胞粘附因子中的成員，在正常的上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)常下調(diào)，對(duì)同質(zhì)型粘附具有重要作用[7]。MMP-11和MMP-14是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的成員，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和Ⅳ型膠原的降解作用強(qiáng)，其異常表達(dá)后可以引起腫瘤轉(zhuǎn)移屏障降解，使腫瘤細(xì)胞易于離開(kāi)原發(fā)灶形成轉(zhuǎn)移灶，為腫瘤侵襲提供重要的幫助[8-9]。

本研究顯示miR-362-3p在前列腺增生和前列腺癌組織中的表達(dá)有明顯差異，提示miR-362-3p表達(dá)下調(diào)是腫瘤形成的重要分子事件。前列腺增生為非腫瘤性病變的組織，其組織中miR-362-3p具有一定的表達(dá)量，與抑癌基因的作用相似。結(jié)果顯示miR-362-3p在有無(wú)脈管癌栓和轉(zhuǎn)移的表達(dá)中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-362-3p低表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。Gleason分級(jí)和TNM分期是與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)的指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)了miR-362-3p在不同Gleason分級(jí)和TNM分期中的表達(dá)有差異，提示miR-362-3p異常表達(dá)對(duì)判斷腫瘤的生物學(xué)行為可能有一定意義。本研究發(fā)現(xiàn)了miR-362-3p的表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系，提示檢測(cè)miR-362-3p的表達(dá)對(duì)判斷預(yù)后有一定意義，即miR-362-3p低表達(dá)患者的預(yù)后差。MiR-362-3p的作用與較多的下游因子有關(guān)，如通過(guò)CD82促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化[11]，在腎癌中miR-362-3p表達(dá)下降并靶向NEMO樣激酶基因調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展[12]。這些作用與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的miR-362-3p在前列腺癌中表達(dá)的結(jié)果較為一致。相關(guān)分析顯示miR-362-3p與MMP-11、miR-362-3p與MMP-14、miR-362-3p與E-cadherin具有相關(guān)性，提示miR-362-3p低表達(dá)時(shí)可通過(guò)改變上述因子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，也間接證實(shí)了miR-362-3p對(duì)MMP-11、MMP-14和E-cadherin的靶向關(guān)系，但是其具體靶向關(guān)系尚需后續(xù)應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)證實(shí)。MiR-362-3p異常表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附性改變[13-14]，引起細(xì)胞間連接的松散，細(xì)胞易于離開(kāi)原發(fā)灶出現(xiàn)播散，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件。MMP-11和MMP-14高表達(dá)時(shí)能引起腫瘤細(xì)胞周?chē)幕|(zhì)、基底膜和Ⅳ型膠原溶解，使細(xì)胞轉(zhuǎn)移的屏障作用減弱或消失，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移。MiR-362-3p在不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)作用可能不同[15]。趙越等[16]在喉鱗癌中發(fā)現(xiàn)miR-362-3p高表達(dá)，認(rèn)為其在鱗癌中具有癌基因樣的作用，其作用可能與腫瘤的低氧環(huán)境有關(guān)，因此miR-362-3p可能僅在腺癌中具有腫瘤抑制的作用。我們?cè)诨驍?shù)據(jù)庫(kù)的分析中也顯示出E-cadherin、MMP-11和MMP-14是miR-362-3p的下游靶基因，與本實(shí)驗(yàn)的部分結(jié)論具有一致性。E-cadherin是與miR-362-3p關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的因子，提示miR-362-3p對(duì)調(diào)控粘附的作用更強(qiáng)。MMP-11和MMP-14被活化后其下游調(diào)節(jié)通路多且復(fù)雜[9]。MMP-14也受控于多種因子[17-18]，MMP-14在MMPs調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中可能具有核心調(diào)控作用[19]。miR-362-3p與前列腺癌預(yù)后的關(guān)系是本研究中的重要發(fā)現(xiàn)，但是由于本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本收集的局限性，尚需要后續(xù)進(jìn)行多中心、大樣本分析驗(yàn)證后明確。

總之，miR-362-3p在前列腺癌中低表達(dá)，與轉(zhuǎn)移指標(biāo)具有相關(guān)性，可能是判斷前列腺癌預(yù)后的指標(biāo)。