郭 琰，徐 琳，馬 駿，向定成，阮云軍，曾婭玲，黃建玉，廖端芳*

(1.中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510010；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院老年科，廣東 廣州 510515;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

膽固醇蓄積是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素，而機(jī)體膽固醇代謝與細(xì)胞內(nèi)外蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。作為膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白小凹蛋白-1(Caveolin-1，CAV-1)是富含于小凹結(jié)構(gòu)的一種分子量為21kD的蛋白質(zhì)，除此之外還具有維持細(xì)胞膜穩(wěn)定、負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)通路、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[1]。親環(huán)素A(cyclophilin A，CYPA)是親免素家族成員，分子量為18kD，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)CAV-1結(jié)合區(qū)[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道CAV-1與CYPA聯(lián)合參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。環(huán)孢素A(cyclosporin A，CSA)是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的與CYPA具有高度親和性，并具有抑制CYPA活性作用的多肽[4]。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)優(yōu)勢(shì)表達(dá)CYPA，且與CAV-1共存[5]。本研究擬在荷脂不同時(shí)間的VSMCs荷脂模型上，觀察膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物CYPA與CAV-1表達(dá)的變化，及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響；并應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)抑制CYPA活性藥物CSA處理細(xì)胞，觀察其對(duì)CYPA與CAV-1結(jié)合的影響，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白，探索動(dòng)脈粥樣硬化形成的病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自北京四季清公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)GIBCO；胰蛋白購(gòu)自美國(guó)Hyelone公司；Western Blot熒光檢測(cè)試劑盒、CAV-1購(gòu)自Santa Cruz(USA)公司；CYPA購(gòu)自UpState(USA)公司；CSA、麗春紅染色試劑、油紅O染料購(gòu)自Sigma(USA)公司；Trypsin 1∶250、Tween-20、SDS、Tris-Base、AmmoniμM Persulfate、Glycine、TEMED購(gòu)自USA Amresco,Inc.；β-actin、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、FITC熒光標(biāo)記的山羊抗兔、Prestained Protein Marker、Mouse Anti-β-Actin購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞提取及培養(yǎng) 取120～150 g SD大鼠，無(wú)菌條件下分離大鼠胸主動(dòng)脈，將血管中膜平滑肌層剪成組織塊進(jìn)行培養(yǎng)，孵育箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化傳代。顯微鏡觀察：細(xì)胞形態(tài)多樣呈長(zhǎng)梭形或梭形，細(xì)胞間有突起相連，呈典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)用長(zhǎng)勢(shì)良好的3～10代細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)分為未加任何因素培養(yǎng)的正常平滑肌細(xì)胞作為空白對(duì)照組(control組)、用Ox-LDL 75 μg/mL孵育24、48、72 h組、Ox-LDL 75 μg/mL預(yù)孵育48 h后用CSA 1 μM處理1 h組(CSA組)、Ox-LDL 75 μg/mL預(yù)孵育48 h后DMSO處理組作為溶酶對(duì)照1 h組(DMSO組)。

1.2.2 低密度脂蛋白的氧化修飾及鑒定 參照課題組既往方法[5],取未加抗凝劑的健康人新鮮血液，提取出LDL進(jìn)行氧化修飾。氧化修飾后的LDL(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)經(jīng)超濾除菌，BCA試劑定量蛋白，調(diào)蛋白濃度至lg/L用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì) 將細(xì)胞接種于預(yù)先放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至60%融合，換用含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加不同的處理因素。處理結(jié)束后，用PBS沖洗3次，50%異丙醇固定1 min，油紅O染色液染色10 min，去離子水沖洗3次，蘇木素染色。分色和返藍(lán)后，顯微鏡下觀察，HPIS-1000型圖象分析系統(tǒng)收集圖像。

1.2.4 Western-blot法檢測(cè) CYPA,CAV-1和β-actin蛋白表達(dá)參照課題組既往方法[5]，收集不同條件處理的VSMCs細(xì)胞，用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯示結(jié)果于X光片。Epson1650photo掃描儀收集圖像，以面積和光密度的乘積即積分光密度表示。

1.2.5 高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇 按文獻(xiàn)方法[6]，待VSMCs處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，裂解細(xì)胞，BCA定量、離心，留上清進(jìn)行膽固醇檢測(cè)。以豆甾醇為內(nèi)標(biāo)并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取上清液加入氫氧化鉀溶液，水解膽固醇酯后為細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol TC)樣品，加NaOH為游離膽固醇樣品。各樣品分別與內(nèi)標(biāo)液混勻，用正己烷和無(wú)水乙醇抽提后，三氧化鉻進(jìn)行氧化衍生并真空干燥，乙晴-異丙醇溶解樣品，上樣于高效液相色譜儀。采用C-18柱，柱溫4 ℃，流速1 mL/min，250 nm紫外光檢測(cè)，膽固醇以峰面積定量，內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，以μg/mg細(xì)胞蛋白為單位。細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯(CE)含量為T(mén)C與游離膽固醇(FC)的差值。

1.2.6 間接免疫熒光方法檢測(cè)CYPA和CAV-1的蛋白表達(dá)及定位 VSMCs接種于12孔板中，經(jīng)分組處理后，用預(yù)熱至37 ℃的PBS洗3遍，用10%甲醛固定(4 ℃，過(guò)夜)或(37 ℃，15分鐘)，棄去孔板內(nèi)液體，加1 mL穿透液(放置37 ℃，20 min)，棄去穿透液，加CYPA或CAV-1一抗(37 ℃孵育2 h)，TBST洗3遍，棄去洗液，加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(37 ℃，避光孵育30 min)，TBST洗3遍后穿透液清洗，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 免疫共沉淀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CYPA和CAV-1的相互作用 參照課題組既往方法[5]，提取細(xì)胞蛋白，部分進(jìn)行定量等操作，用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯示結(jié)果于X光片。Epson1650photo掃描儀收集圖像，以面積和光密度的乘積即積分光密度表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，后用最小有意義差異t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間的多重比較，以P<0.05判定差異有無(wú)顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.2 Ox-LDL對(duì)VSMCs處理不同時(shí)間對(duì)CAV-1和CYPA表達(dá)的影響

用Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)細(xì)胞用75 mg/L Ox-LDL處理不同時(shí)間后，CAV-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相對(duì)密度比較，24 h由1.3±0.065下降到0.90±0.017，48 h下降到0.58±0.027，72 h下降到0.35±0.045，差異均有顯著性(P<0.05)；CYPA蛋白表達(dá)與對(duì)照組3.38±0.25相比，24 h為2.74±0.19，48 h為2.27±0.03，72 h為1.76±0.05。CAV-1和CYPA蛋白隨荷脂時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸減低，差異均有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 Ox-LDL處理不同時(shí)間對(duì)VSMCs內(nèi)CAV-1與CYPA定位表達(dá)的影響

間接免疫熒光定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：用75 mg/L Ox-LDL對(duì)VSMCs處理不同的時(shí)間(24，48，72h)，Ox-LDL顯著抑制VSMCs中CYPA與CAV-1在胞膜、胞漿中的表達(dá)，與對(duì)照組相比，當(dāng)細(xì)胞處理24，48，72h后熒光強(qiáng)度逐漸降低，見(jiàn)圖2。

圖1 Ox-LDL處理VSMCs不同時(shí)間對(duì)CAV-1和CYPA蛋白表達(dá)的影響與control組比較，a P<0.05；與24 h組比較，b P<0.05；與48 h組比較,c P<0.05(n=3)

圖2 Ox-LDL處理不同時(shí)間對(duì)VSMCs內(nèi)CAV-1和CYPA定位表達(dá)的影響(200×)

2.3 Ox-LDL處理不同時(shí)間對(duì)VSMCs荷脂的影響

用75 mg/L Ox-LDL對(duì)VSMCs處理不同的時(shí)間(24，48，72 h)，用油紅O染色顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著Ox-LDL作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)紅色顆粒逐漸增加，當(dāng)Ox-LDL處理細(xì)胞48及72 h后，胞漿內(nèi)大量紅色顆粒存在，細(xì)胞荷脂明顯，見(jiàn)圖3。

圖3 Ox-LDL處理細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)VSMCs內(nèi)脂滴形成的影響(200×)

2.4 Ox-LDL處理不同時(shí)間VSMCs內(nèi)脂質(zhì)含量變化

用75 mg/L Ox-LDL對(duì)VSMCs處理不同的時(shí)間(24，48，72h)，高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Ox-LDL作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)TC含量不斷增加，由未處理組的133.82±5.62 μg/mg增加至24 h的291.01±8.36 μg/mg，48 h為425.91±2.22 μg/mg，72 h為532.79±3.45 μg/mg；細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量由124.46±6.35 μg/mg上升至24 h的227.62±7.66 μg/mg，48 h為285.92±6.18 μg/mg，72 h為320.54±2.11 μg/mg。CE/TC值與0 h 7.53±1.04%相比，24 h 19.95%±4.95%，48 h 34.16±1.32%，72 h 40.15±0.59%，差異均有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 Ox-LDL處理不同時(shí)間對(duì)VSMCs內(nèi)膽固醇含量的影響(n=3)與0 h組比較,a P<0.05；與24 h組比較,b P<0.05；與48 h組比較,c P<0.05

2.5 CSA對(duì)CAV-1和CYPA的蛋白表達(dá)有無(wú)明顯影響

Western blot檢測(cè)：用75 mg/L Ox-LDL處理VSMCs48h后，對(duì)照組為未加CSA處理，另一組用1 μM CSA處理細(xì)胞1 h，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)顯著性，(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

2.6 CSA對(duì)CYPA與CAV-1結(jié)合能力的影響

免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn)：CYPA與CAV-1相互作用；用1 μM CSA處理細(xì)胞1h后抑制CYPA活性，CYPA與CAV-1的蛋白結(jié)合能力降低，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖5 用1 μM CSA處理荷脂細(xì)胞1 h對(duì)CYPA和CAV-1表達(dá)影響與control組比較，P>0.05

圖6 CSA對(duì)CYPA與CAV-1結(jié)合能力的影響與control組比較，a P<0.01(n=3)

2.7 CSA對(duì)VSMCs荷脂的影響

實(shí)驗(yàn)分四組：control、Ox-LDL 48 h、Ox-LDL 48 h+DMSO 1 h和Ox-LDL 48 h+1 μM CSA 1 h。用油紅O染色顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，Ox-LDL 48 h組胞漿內(nèi)紅色顆粒增多，Ox-LDL 48 h組與DMSO組差別不明顯，與DMSO及48h組相比，CSA組的VSMCs胞漿內(nèi)紅色顆粒明顯增多，見(jiàn)圖7。

圖7 Ox-LDL處理不同時(shí)間對(duì)VSMCs內(nèi)脂質(zhì)含量的影響(200×)

2.8 CSA抑制CYPA活性后對(duì)VSMCs內(nèi)外膽固醇含量的影響

高效液相色譜法檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，Ox-LDL處理48h后細(xì)胞外培養(yǎng)液中膽固醇含量由40.17±1.15 μg/mg下降至20.4±0.83 μg/mg，Ox-LDL48h組與DMSO組差別不明顯，與DMSO組相比，處理了CSA的VSMCs外TC降至16.51±0.79 μg/mg，差異有顯著性(P<0.05)。與DMSO組相比，細(xì)胞內(nèi)TC由73.14±6.87 μg/mg增至145.90±9.80 μg/mg，差異有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖8。

圖8 CSA處理后對(duì)VSMC細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量的影響與對(duì)照組比較，a P<0.05，c P<0.01；與Ox-LDL 48 h+DMSO比較，b P<0.05(n=3)

3 討 論

隨著社會(huì)生活水平提高，人口結(jié)構(gòu)的老齡化，心血管疾病的數(shù)量在急劇增加，而動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病是最常見(jiàn)死因之一，嚴(yán)重威脅到人類(lèi)生命健康[7-8]。動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素參與的慢性疾病[9-11]，其中細(xì)胞攝取過(guò)多脂質(zhì)泡沫化是動(dòng)脈粥樣硬化最危險(xiǎn)的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一[12]。本實(shí)驗(yàn)用75 mg/L Ox-LDL與VSMCs細(xì)胞共同孵育不同的時(shí)間，油紅O染色觀察，在Ox-LDL處理細(xì)胞24，48及72h后，細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴的形成。這說(shuō)明Ox-LDL損傷細(xì)胞內(nèi)膽固醇自平衡機(jī)制，抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[13]。

CAV-1存在于心血管系統(tǒng)的大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中，是一種高親和力的脂質(zhì)結(jié)合蛋白，具有結(jié)合、運(yùn)載膽固醇的功能并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的流出，對(duì)維持細(xì)胞膽固醇的穩(wěn)態(tài)起著重要調(diào)節(jié)作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中CAV-1的表達(dá)隨著Ox-LDL處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，伴隨細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加。結(jié)合文獻(xiàn)及課題組前期結(jié)果：CAV-1高表達(dá)能抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[16-17]。說(shuō)明CAV-1表達(dá)與Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞膽固醇蓄積密切相關(guān)。

CYPA是親免素家族成員之一，當(dāng)VSMCs受到炎癥刺激后能夠分泌該蛋白[18]。研究報(bào)道CYPA不僅參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的形成，還可作為一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)分泌的生長(zhǎng)因子促進(jìn)VSMCs增殖和炎癥細(xì)胞的體外遷移[19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫共沉淀證明了CYPA和CAV-1在大鼠VSMCs內(nèi)相互結(jié)合，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[3]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著Ox-LDL處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CYPA的蛋白表達(dá)逐漸減弱。提示Ox-LDL對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，可能使CYPA與CAV-1的表達(dá)下調(diào)，從而部分抑制CYPA與CAV-1的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

有文獻(xiàn)報(bào)道CYPA的抑制劑CSA常作為免疫抑制劑治療相關(guān)疾病同時(shí)可導(dǎo)致患者LDL-膽固醇水平升高，加重動(dòng)脈粥樣硬化[20]。因此本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，CSA可能還可以通過(guò)抑制CYPA的活性來(lái)影響由CAV-1介導(dǎo)的膽固醇流出。實(shí)驗(yàn)通過(guò)Ox-LDL處理VSMCs 48 h，再用1 μM的CSA處理細(xì)胞1 h，免疫共沉淀結(jié)果顯示處理組與對(duì)照組相比，蛋白結(jié)合減少。而CSA對(duì)該兩種蛋白的表達(dá)并無(wú)明顯影響，間接證明了CSA可能是通過(guò)抑制VSMCs內(nèi)CYPA的活性而影響它與CAV-1的結(jié)合作用。并且當(dāng)荷脂細(xì)胞用CSA處理后，與對(duì)照組相比，處理組胞漿內(nèi)脂滴明顯增加。同時(shí)用高效液相色譜分析細(xì)胞內(nèi)外TC含量比值來(lái)推測(cè)CYPA活性受到抑制后對(duì)血管平滑肌細(xì)胞吞噬脂質(zhì)或膽固醇流出的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Ox-LDL誘導(dǎo)48 h組相比，處理CSA1h后,細(xì)胞外膽固醇比值降低，相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的TC含量比對(duì)照組要多。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都推測(cè)CSA處理VSMCs后可能通過(guò)抑制CYPA活性從而降低CYPA與CAV-1結(jié)合，而增加VSMCs內(nèi)膽固醇的蓄積。

本研究結(jié)果提示Ox-LDL通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)CYPA與CAV-1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇蓄積。如抑制細(xì)胞內(nèi)CYPA活性可降低VSMCs內(nèi)CYPA與CAV-1的相互作用，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇蓄積。結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，接下來(lái)的研究中我們將采用CYPA與CAV-1基因敲除小鼠開(kāi)展相關(guān)工作，進(jìn)一

步探討膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，尋找動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病治療中的新靶點(diǎn)。