吉家興，馬 俊，李 博，王麗萍，許 鳴*

(廣東省第二人民醫(yī)院 1.藥學(xué)部，2.消化內(nèi)科，廣東 廣州 510317；3.佛山市第二人民醫(yī)院消化科，廣東 佛山 528031)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一種促纖維化細(xì)胞因子，在大部分器官系統(tǒng)纖維化的發(fā)展中起著核心作用。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)是各種原因?qū)е赂卫w維化發(fā)生纖維化的最終共同途徑。研究表明，TGF-β可誘導(dǎo)HSC增殖和分化[1]。前期研究顯示，黃芩素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化，其機(jī)制與其抑制NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)介導(dǎo)的活性氧(reactive oxygen specices,ROS)的產(chǎn)生有關(guān)。Smad信號(hào)通路在TGF-β介導(dǎo)的纖維化過程中起核心調(diào)控作用[2]。本研究擬以HSC-T6細(xì)胞為研究對(duì)象，闡明黃芩素是否通過Smad信號(hào)通路抑制TGF-β1介導(dǎo)的HSC-T6活化。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司，具有活化HSC的表型；黃芩素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自吉泰生物公司；鼠抗α-SMA單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；磷酸化Smad 2和Smad 3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；總Smad 2和Smad 3單克隆抗體為美國(guó)Bioworld公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) HSC-T6放在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37 ℃,50%CO2及飽和濕度下培養(yǎng),傳代至6孔板或15 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。除對(duì)照組和TGF-β1(5 μg/L)刺激組外,其他加藥組分別加入各終濃度的黃芩素預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞30 min后，再加入含TGF-β1(5 μg/L)的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞48 h。

1.2.2 細(xì)胞的分組 細(xì)胞分6組，A組：空白對(duì)照組；B組：TGF-β1刺激組；C組：TGF-β1+125 nmol/L黃芩素組；D組：TGF-β1+250 nmol/L黃芩素組；E組：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組；F組：TGF-β1+1 000 nmol/L黃芩素組。黃芩素劑量參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30分鐘，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘，滴加生物素化二抗，DAB顯色，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻加至爬片，蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明、封片。每組圖片取6個(gè)視野，采取日本OLYMPUS攝像系統(tǒng)和日本MetaMorph/BX41圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值，光密度值越大，代表樣本中目的蛋白含量越多。

1.2.4 Western blot法 細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液加PMSF冰上裂解30 min,收集裂解物,于4 ℃、12 000 r/min離心30 min,BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg,進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h,再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉3 h,加入一抗,4 ℃過夜。次日辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h,后洗膜4次,最后用發(fā)光劑進(jìn)行檢測(cè),曝光、顯影,以β-actin作為內(nèi)參,分別以目的蛋白與β-actin光密度比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析后，進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)。取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果如圖1所示，各組相對(duì)密度分析如圖2所示，與對(duì)照組比較，TGF-β1處理后，HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)明顯增加；與TGF-β1處理組比較，黃芩素預(yù)處理后，隨著黃芩素濃度的增加ɑ-SMA表達(dá)顯著下降(F=72.40，P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，其中500 nmol/L黃芩素預(yù)處理組作用最強(qiáng)，因此選擇500 nmol/L黃芩素預(yù)處理做后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 免疫組織化學(xué)分析HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)(HE 200×)

圖2 HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)的相對(duì)密度分析A組:對(duì)照組;B組:TGF-β1刺激組;C組:TGF-β1+125 nmol/L黃芩素組;D組：TGF-β1+250 nmol/L黃芩素組；E組：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組；F組：TGF-β1+1 000 nmol/L黃芩素組.與對(duì)照組比較，#P<0.01;與TGF-β1刺激組比較，*P<0.05

2.2 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞Smad表達(dá)的影響

Western blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HSC-T6細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用后,與對(duì)照組相比,Smad磷酸化水平p-Smad 2、p-Smad 3明顯上調(diào)(t=5.841、7.453,P<0.01)。經(jīng)500 nmol/L黃芩素預(yù)處理后,p-Smad 2、p-Smad 3表達(dá)與TGF-β1處理組比較p-Smad 2、p-Smad 3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.886、1.638,P>0.05)。

圖3 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞Smad表達(dá)的影響A：蛋白電泳圖；B：蛋白表達(dá)的相對(duì)密度圖1：對(duì)照組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組.與對(duì)照組比較，#P<0.01

3 討 論

TGF-β能夠促進(jìn)肝纖維化，其機(jī)理與其能顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖與活化有關(guān)。前期研究表明，給予TGF-β1處理HSC-T6細(xì)胞后,HSC-T6細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)中亦觀察到TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞后，后者α-SMA表達(dá)升高，給予黃芩素預(yù)處理細(xì)胞可抑制TGF-β1誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的α-SMA表達(dá)升高，說明黃芩素抑制TGF-β1誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的活化。

NOX是一組含血紅素的跨膜蛋白，是吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞的重要ROS產(chǎn)生因子[4]。已鑒定出NOX家族中的7個(gè)成員：Nox 1，NOX 2，NOX 3，NOX 4，NOX 5，雙氧化酶1(Duox1)和雙氧化酶2(DUOX 2)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可誘導(dǎo)不同類型細(xì)胞中NOX 1、NOX 2和NOX 4等NOX酶的表達(dá)[5]。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中，觀察到不同濃度(125、250、500、1 000 nmol/L)黃芩素預(yù)處理HSC-T6后細(xì)胞內(nèi)NOX的活性顯著低TGF-β1處理組，而500、1 000 nmol/L黃芩素組NOX的活性比較無明顯差異；黃芩素預(yù)處理后HSC-T6后細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)較TGF-β1刺激組明顯下降，說明黃芩素可通過抑制HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NOX活性，降低ROS的產(chǎn)生，從而抑制由TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化。

TGF-β1與細(xì)胞膜上的Ⅱ型受體(TGF-βR-II)結(jié)合，激活I(lǐng)型受體(TGF-βR-I)，導(dǎo)致Smad 2和Smad 3磷酸化。磷酸化的Smad 2和Smad 3與共同介質(zhì)Smad 4形成復(fù)合物轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過與靶基因啟動(dòng)子中存在的Smad結(jié)合元件結(jié)合而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1通過smad 2/3途徑在多種病理?xiàng)l件下的肝纖維化的發(fā)展中起著核心作用[7]。因此，我們以TGF-β1/Smad信號(hào)通路為靶標(biāo)，進(jìn)一步研究黃芩素通過降低NOX活性下調(diào)的ROS，是否通過Smad途徑達(dá)到抑制HSC-T6活化的目的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSC-T6經(jīng)500 nmol/L黃芩素預(yù)處理后,p-Smad 2、p-Smad 3表達(dá)與TGF-β1處理組比較p-Smad 2、p-Smad 3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究表明TGF-β1可以通過smad 2/3途徑誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞活化。黃芩素雖然可以通過其抗氧化特性抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化，但將其作用于HSC-T6后未能影響p-Smad 2、p-Smad 3的表達(dá)。研究表明，通過其他非經(jīng)典途徑，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3k)途徑和Rho-類似GTP酶途徑等途徑的信號(hào)傳遞對(duì)TGF-β的促纖維化活性也是至關(guān)重要的[8-9]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，黃芩素可能不是通過Smad信號(hào)途徑影響HSC-T6的活化。黃芩素是否通過非經(jīng)典途徑如MAPK等途徑抑制TGF-β表達(dá)，達(dá)到其抗肝纖維化的作用是我們下一步研究的目標(biāo)。