周湘華，趙其輝，張志偉

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

胃癌(Gastric carcinoma，GC)是我國(guó)的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率位列第二位，位列消化道惡性腫瘤第一位[1]。胃癌的有效防治取決于早期預(yù)防、早期診斷與早期治療，而新方法與技術(shù)的發(fā)現(xiàn)對(duì)其防治具有十分重要的意義。課題組前期鑒定出243個(gè)胃黏膜癌變相關(guān)蛋白質(zhì)[2]，證實(shí)組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Tissue Transglutaminase，TGM2)在胃癌組織中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生相關(guān)[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)，TGM2在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究初步探討miR-924對(duì)TGM2表達(dá)的調(diào)節(jié)和MGC803細(xì)胞增殖的影響，為闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人胃癌MGC803細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，由本實(shí)驗(yàn)室保存提供，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 引物序列 采用miRBase在線生物信息學(xué)軟件(http://www.mirbase.org/)獲取miR-924 mimics相應(yīng)序列。通過(guò)TargetScan 6.2生物信息學(xué)軟件(http://www.targetscan.org/)，搜尋包含miR-924結(jié)合位點(diǎn)的TGM2 3′UTR序列片段，利用Premier 5分析序列，根據(jù)miR-924結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)突變位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(TGM2引物：CCGAGGAGCTGGTCTTAGAG，TCTTAGTGGAAAAC GGGCCT；β-actin引物：GGGCACGAAGGCTCATCA TT，AGCGAGCATCCCCCAAAGTT)。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)測(cè)調(diào)控TGM2基因表達(dá)的miRNAs 采用miRwalk、miRanda、microRNA.org、HOCTAR、TargetScan與EMBL-EBI等軟件預(yù)測(cè)靶向調(diào)節(jié)TGM2基因表達(dá)的miRNAs，在10個(gè)軟件中有5個(gè)或5個(gè)以上軟件中預(yù)測(cè)到的miRNAs，以次數(shù)與不同軟件網(wǎng)站中的得分排名為候選miRNAs。分析調(diào)控TGM2表達(dá)的micRNA及與TGM2基因3′UTR序列片段結(jié)合的位點(diǎn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將MGC803細(xì)胞接種于6孔板中，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為MGC803細(xì)胞組、無(wú)關(guān)序列組與miR-924 mimics三組，擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置20 μL體系：miR-924或U6特異性引物0.4 μL、Taq DNA polymerase 0.2 μL、U6 RT product 2.0 μL、2×SYBR Mix 10 μL、無(wú)酶水7.4 μL，經(jīng)real-time PCR儀PCR擴(kuò)增(95.0 ℃ 3 min；95.0 ℃ 12 s；62.0 ℃ 35 s，40 cycles)。熔解曲線檢測(cè)從62.0 ℃至95.0 ℃，計(jì)算不同細(xì)胞的CT值，miR-924表達(dá)用ΔCT進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因活性分析 將MGC803細(xì)胞接種于6孔板中，將miR-924mimics、pMIR-report載體及0.5 μg β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒(對(duì)照)共轉(zhuǎn)染48 h后，采用單光子檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性，計(jì)算熒光素酶報(bào)告基因活性相對(duì)值(熒光素酶報(bào)告基因活性值/β-半乳糖苷酶活性)。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將細(xì)胞接種于96孔板中，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為MGC803細(xì)胞組、無(wú)關(guān)序列組與miR-924 mimics三組，將96孔板放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO溶解紫藍(lán)色結(jié)晶，置于ELX800酶標(biāo)儀中檢測(cè)每孔吸光值(檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm)，重復(fù)檢測(cè)96孔板中每孔細(xì)胞的吸光度值(OD值)，每天檢測(cè)細(xì)胞一次，將每孔檢測(cè)值與第1天檢測(cè)值比較值代表檢測(cè)校正值，連續(xù)檢測(cè)7天，將校正值連線繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.6 平皿克隆形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板中，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為MGC803細(xì)胞組、無(wú)關(guān)序列組與miR-924 mimics三組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周左右，結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞克隆染色，倒置顯微鏡或肉眼觀察細(xì)胞克隆形成情況(肉眼可視或顯微鏡下細(xì)胞大于50個(gè)為克隆)，計(jì)算克隆形成率(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.7 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 用培養(yǎng)基與瓊脂糖加熱混合調(diào)整濃度為0.6%，加入6孔板每孔中冷卻制備底層瓊脂；用培養(yǎng)基與瓊脂糖加熱混合調(diào)整濃度為0.3%，分別加入細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)，加入底層瓊脂上制備頂層瓊脂，分為MGC803細(xì)胞組、無(wú)關(guān)序列組與miR-924 mimics三組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成情況(大于50細(xì)胞為集落)，每孔隨機(jī)選取10個(gè)低倍鏡視野，計(jì)數(shù)集落形成率(集落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.8 Western blot檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用10%不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶漂洗PVDF膜，非特異性封閉2 h，用1∶1 000稀釋一抗與1∶2 000稀釋?duì)?actin單抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗PVDF膜，用1∶1 000稀釋羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗PVDF膜，經(jīng)發(fā)光、壓片、顯影和定影后，經(jīng)灰度掃描后計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)的灰度值，分析蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，不同組間比較采用q檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)控TGM2表達(dá)的miRNAs分析

采用miRwalk在線軟件(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk)預(yù)測(cè)和分析調(diào)控TGM2基因表達(dá)的miRNAs(圖1)。10個(gè)軟件中有5個(gè)或5個(gè)以上軟件出現(xiàn)者為候選miRNA。通過(guò)miRanda(http://www.microrna.org/microrna/)進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性和序列保守性評(píng)分分析。結(jié)果顯示miR-924與miR-450b-3p與TGM2基因靶向結(jié)合最佳(表1)。

圖1 生物信息學(xué)軟件分析調(diào)控TGM2表達(dá)的miRNAs綠色代表該軟件預(yù)測(cè)到miRNA與靶基因有結(jié)合，紅色(0)代表該軟件沒(méi)有預(yù)測(cè)到結(jié)合，hsa是指人類的miRNA

表1 調(diào)控TGM2基因表達(dá)的相關(guān)miRNAs

注：滿足熱力學(xué)穩(wěn)定性評(píng)分(mirSVR)≤-0.1與序列保守性評(píng)分(PhastCons)在0.5～0.7之間者為有效miRNA，一個(gè)數(shù)值代表一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)評(píng)分

2.2 miR-924與TGM2基因結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

采用Targetscan在線生物信息學(xué)軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miR-924與TGM2基因3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-924與TGM2基因3′UTR的864-871位核苷酸結(jié)合(圖2)。因?yàn)閙iR-924與TGM2基因3′-UTR區(qū)域僅一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所以選擇其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 miR-924與TGM2基因3′UTR結(jié)合分析

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了胃腺癌MGC803、SGC7901、AGS細(xì)胞和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中miR-924的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-924在MGC803細(xì)胞中表達(dá)最低(圖3，P<0.05)。然后通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)miR-924對(duì)TGM2基因啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果表明，TGM2基因3′UTR突變序列與miR-924 mimics或miR-Control共轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后熒光素酶活性強(qiáng)度基本一致，但TGM2基因3′UTR序列與miR-924 mimics或miR-Control共轉(zhuǎn)染后，其中miR-924 mimics的熒光素酶活性明顯降低(圖4，P<0.05)，說(shuō)明miR-924可與TGM2基因3′UTR靶向結(jié)合。

圖2 Targetscan預(yù)測(cè)miR-924與TGM2基因的靶向性結(jié)合

圖3 qRT-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞中miR-924的表達(dá)與GES-1細(xì)胞比較，*P<0.05

圖4 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)miR-924可與TGM2基因3′UTR的結(jié)合與miR-Control組比較，*P<0.05

2.4 miR-924對(duì)TGM2基因表達(dá)的影響

將miR-924 mimics和miR-Control分別轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)TGM2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-924高表達(dá)后，MGC803細(xì)胞中TGM2基因mRNA及蛋白質(zhì)均降低(圖5，P<0.05)，說(shuō)明miR-924可抑制TGM2基因的表達(dá)。

圖5 miR-924對(duì)TGM2基因表達(dá)的影響A：qRT-PCR檢測(cè)TGM2基因mRNA的表達(dá)，與MGC803組和miR-Control組比較，*P<0.05；B：Western blot檢測(cè)TGM2蛋白質(zhì)的表達(dá)

2.5 miR-924對(duì)MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞，計(jì)算每組細(xì)胞的檢測(cè)校正值，連續(xù)檢測(cè)7天，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，與MGC803組和miR-Control組比較，miR-924高表達(dá)后MGC803細(xì)胞的生長(zhǎng)速度降低(圖6，P<0.05)。

圖6 生長(zhǎng)曲線觀察miR-924對(duì)MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與MGC803組和miR-Control組比較，*P<0.05

2.6 miR-924對(duì)MGC803細(xì)胞克隆形成的影響

采用平皿克隆觀察miR-924高表達(dá)對(duì)細(xì)胞平皿克隆形成的影響。結(jié)果顯示，MGC803、miR-Control和miR-924組細(xì)胞克隆數(shù)分別為(186.04±36.15)、(179.23±29.14)和(86.22±16.24)，與MGC803細(xì)胞組和miR-Control組比較，miR-924高表達(dá)后細(xì)胞克隆體積變小，數(shù)目減少，細(xì)胞克隆形成率降低(表2，P<0.05)。

表2 miR-924對(duì)MGC803細(xì)胞克隆形成的統(tǒng)計(jì)分析

與MGC803組和miR-Control組比較，aP<0.05

2.7 miR-924對(duì)MGC803細(xì)胞集落形成的影響

采用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-924高表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞集落形成的影響。結(jié)果顯示，MGC803、miR-Control和miR-924組細(xì)胞集落數(shù)分別為(269.05±36.16)、(258.24±29.76)和(158.26±16.58)，與MGC803細(xì)胞組和miR-Control組比較，miR-924高表達(dá)后細(xì)胞集落體積變小，數(shù)目減少，細(xì)胞集落形成率降低(表3，P<0.05)。

表3 miR-924對(duì)MGC803細(xì)胞集落形成的統(tǒng)計(jì)分析

與MGC803組和miR-Control組比較，aP<0.05

2.8 miR-924對(duì)JAK3/STAT3信號(hào)通路的影響

采用Western blot檢測(cè)MGC803、miR-Control和miR-924組細(xì)胞中JAK3與STAT3蛋白表達(dá)及兩者磷酸化情況，檢測(cè)miR-924對(duì)JAK3/STAT3信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，miR-924高表達(dá)后MGC803細(xì)胞中JAK3、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，但JAK3、STAT3蛋白(Y705)的磷酸化水平降低(圖7，P<0.05)。

圖7 miR-924對(duì)JAK3/STAT3信號(hào)通路的影響A：Western blot檢測(cè)JAK3與STAT3蛋白表達(dá)及兩者磷酸化情況；B：JAK3與STAT3蛋白表達(dá)及兩者磷酸化的灰度統(tǒng)計(jì)分析圖；與MGC803組和miR-Control組比較，*P<0.05

3 討 論

TGM2屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族成員之一，普遍存在于組織中參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程，不同細(xì)胞中TGM2具有不同的生物學(xué)功能[4]。TGM2在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、惡性黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腫瘤組織中均高表達(dá)[5]。TGM2表達(dá)后可激活FAK酪氨酸激酶，使PI3/AKT等抗凋亡信號(hào)通路活化，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[6]。干擾TGM2表達(dá)后，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，抑制細(xì)胞的遷移，使細(xì)胞的死亡增加[7]。有研究者報(bào)道，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)可誘導(dǎo)TGM2蛋白表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥及下降細(xì)胞的凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGM2在MGC803細(xì)胞中表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞增殖能力降低，說(shuō)明TGM2表達(dá)可能參與了促進(jìn)細(xì)胞增殖，與課題組前期及以往的研究結(jié)果基本一致。

目前發(fā)現(xiàn)miRNAs在胃癌細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。miR-133a抑制胃癌細(xì)胞中TAGLN2基因表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖[9]。miR-374a抑制胃癌細(xì)胞中SRCIN1基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移[10]。為了進(jìn)一步了解TGM2促進(jìn)MGC803細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)miR-924可與TGM2基因3′UTR的864-871位核苷酸結(jié)合，其高表達(dá)后TGM2表達(dá)降低，生長(zhǎng)速度減慢，增殖能力也降低。結(jié)果說(shuō)明miR-924可抑制MGC803細(xì)胞增殖，其可能通過(guò)抑制TGM2表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖。在熒光素酶實(shí)驗(yàn)中，本對(duì)照組miR-924 inhibitor存在部分表達(dá)活性降低(結(jié)果未列出)，可能存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)問(wèn)題或者影響其他miRNAs的作用，有待后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)其相互作用情況。miRNAs與基因表達(dá)間存在多基因調(diào)節(jié)關(guān)系，是否存在miR-924抑制TGM2表達(dá)同時(shí)，也抑制其他基因表達(dá)，有待后續(xù)的繼續(xù)研究。

JAK/STAT信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)通過(guò)之一，其活化異常影響細(xì)胞的多種生物學(xué)行為[11]。有研究報(bào)道，STAT3與實(shí)體瘤發(fā)病密切相關(guān)，活化后參與細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。STAT3活化通過(guò)其蛋白磷酸化方式實(shí)現(xiàn)，具有Y705酪氨酸磷酸化位點(diǎn)與S727絲氨酸磷酸化位點(diǎn)[12]。JAKs對(duì)STAT3活化主要通過(guò)Y705位點(diǎn)酪氨酸磷酸化實(shí)現(xiàn)，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能[13]。本文作者發(fā)現(xiàn)，miR-924高表達(dá)后抑制TGM2表達(dá)，MGC803細(xì)胞中JAK3與STAT3蛋白(Y705)的磷酸化水平降低，結(jié)果說(shuō)明JAK3/STAT3通路活化受抑制，我們推測(cè)miR-924調(diào)節(jié)TGM2表達(dá)的同時(shí)，可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)其他蛋白的表達(dá)，或TGM2參與下游相關(guān)信號(hào)通路的活化障礙，使JAK3/STAT3通路活化受阻，降低細(xì)的增殖能力。

總之，本研究初步證實(shí)了miR-924對(duì)TGM2基因表達(dá)的靶向抑制，參與MGC803細(xì)胞的增殖。另外，miR-924表達(dá)可下調(diào)JAK3/STAT3通路活化，抑制MGC803細(xì)胞的增殖。本文為闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制提供了新的思路。