楊邦敏，劉 芳，夏 紅，蘇 堅,3，蘇 波，蘇 琦*

(1.湖南省腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南省胃癌研究中心，南華大學腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.懷化市第一醫(yī)院，湖南 懷化 418000；3.南華大學附屬第二醫(yī)院病理科，湖南 衡陽 421001)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)生率與死亡率分別居于第五位與第三位[1]。我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)生率與死亡率位于第二。胃癌患者往往就診時已經(jīng)發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，治療效果較差，5年生存率低[1-2]。從而，探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機制與治療靶點非常重要。

研究表明，LIM激酶(LIM kinase, LIMK)通過磷酸化和失活cofilin1調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，調(diào)控腫瘤細胞增殖、細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移等[3]。LIMK1在胃癌中高表達與腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關。而沉默LIMK1表達可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)可延緩腫瘤生長和腹膜轉(zhuǎn)移，提示LIMK1可能是胃癌治療的潛在靶點[4]。二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜的一種脂溶性有效成分，具有明顯抑制腫瘤的作用[5]。作者前期工作證明，沉默LIMK1可抑制人胃癌BGC823細胞遷移侵襲[6]。本文進一步探討DADS通過Rac1/LIMK1/cofilin1通路對沉默LIMK1抑制BGC823細胞遷移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人胃癌BGC823細胞由本實驗室保存，于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

LIMK1(Q491)、cofilin1(M1)與p-cofilin1(S3) (Abzoom公司)。ROCK1與PAK1(Epitomics公司)，Rac1(Millipore公司)。Total RNA Kit(Omega公司)，RT reagent kit(TaKaRa公司)，PCR試劑盒(Promega公司)。BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Transwell小室(Corning公司)，Matrigel(BD公司)。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.3 劃痕實驗

調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，吸1 mL細胞懸液接種于6孔板，每組3個平行樣本。RPMI 1640培養(yǎng)液37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，直至形成細胞單層。用10 μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養(yǎng)液洗3次，加新鮮無血清培養(yǎng)基。鏡下測量劃痕區(qū)距離，實驗重復3次。

1.4 侵襲實驗

將基質(zhì)膠稀釋液鋪置在Transwell小室中，100 μL細胞接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液添加至下腔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后取出，擦棄小室上層細胞并用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶祡染色，PBS液洗滌，晾干。鏡下隨機選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值。每組細胞設3個復孔。

1.5 RT-PCR

RNA試劑盒提取細胞總RNA，AMV酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。見表1。PCR反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s，Tm，45 s，72 ℃ 1 min 20 s，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，IS1000圖像分析軟件讀取條帶灰度值，相對值以與β-actin灰度值之比表示。

表1 PCR引物序列

1.6 Western blot

收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組取等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，采用ECL發(fā)光法，最后X片曝光、顯影、定影。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析：實驗重復3次，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差，組間區(qū)別用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 DADS對沉默LIMK1抑制BGC823細胞遷移的影響

劃痕實驗顯示，0 h時，各組劃痕距離基本相同，12 h和24 h后，沉默組疤痕距離分別為(0.66±0.03)與(0.30±0.09)和較對照組(0.35±0.03)與(0.10±0.03)cm呈時間依賴性顯著增加(P<0.05)，而DADS處理沉默組(0.86±0.01)與(0.40±0.01)cm較沉默組明顯增加(P<0.05)(圖1)。表明沉默LIMK1可抑制BGC823細胞遷移能力，DADS可增強沉默LIMK1的抑制遷移作用。

圖1 DADS對LIMK1沉默抑制BGC823細胞遷移的影響與各組0 h比較，*P<0.05；與miR-LIMK1各組BGC823細胞比較，#P<0.05

2.2 DADS對沉默LIMK1抑制BGC823細胞侵襲的影響

侵襲實驗顯示，沉默組穿膜細胞(35±2.86)明顯少于對照組(66±3.56)及空載體組(65±4.35)(P<0.05)。表明沉默LIMK1可抑制BGC823細胞的侵襲能力。并且，DADS處理沉默組穿膜細胞(19±5.07)明顯低于沉默組(P<0.05)(圖2)。證明DADS增強沉默LIMK1抑制侵襲作用。

圖2 DADS對沉默LIMK1抑制BGC823細胞侵襲的影響(200×)與BGC823 and vector比較，*P<0.05；與miR-LIMK1比較，#P<0.05

2.3 DADS及沉默LIMK1對BGC823細胞LIMK1表達的影響

圖3顯示，沉默組LIMK1 mRNA與蛋白表達明顯低于對照組和空載體組，15 mg/L DADS作用24 h后，各處理組明顯低于處理前沉默組、對照組和空載體組(P<0.05)。對照組與空載體組相比之間無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明沉默LIMK1與DADS可下調(diào)LIMK1，而DADS可增強沉默LIMK1抑制LIMK1表達效果。

2.4 免疫細胞化學結果

圖4顯示，LIMK1蛋白在對照組和空載體組細胞漿表達呈強陽性，在沉默組及DADS處理沉默組表達減弱，而DADS處理沉默組更為明顯。

2.5 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Rac1蛋白表達的影響

圖5顯示，沉默組Rac1蛋白表達水平較對照組和空載體組略有降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組和空載體組之間差異無顯著性(P>0.05)。而DADS作用LIMK1沉默組、對照組與空載體組后，Rac1表達明顯下調(diào)(P<0.05)，表明DADS可下調(diào)Rac1表達作用。

2.6 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Pak1蛋白表達的影響

圖6顯示，沉默組Pak1表達水平較對照組和空載體組略有降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組與空載體組無明顯差異(P>0.05)。而DADS作用LIMK1沉默組、對照組與空載體組后，Pak1表達明顯下調(diào)(P<0.05)，表明DADS可抑制Pak1表達。

圖3 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞LIMK1表達的影響A:RT-PCR; B:Western blot; M:mark; 1:BGC823; 2:BGC823+DADS; 3:vector; 4:vector+DADS; 5:miR-LIMK1; 6:miR-LIMK1+DADS與BGC823 and vector比較，*P<0.05；與BGC823+DADS and vector+DADS比較，#P<0.05;與miR-LIMK1比較，$P<0.05

圖4 DADS對LIMK 1沉默BGC823細胞LIMK 1蛋白表達的影響(200×)

圖5 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Rac1表達的作用1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS與BGC823 and vector比較，*P<0.05

圖6 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Pak1蛋白表達的作用1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS與BGC823 and vector比較，*P<0.05

2.7 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞RocK1蛋白表達的影響

結果顯示(圖7)，沉默組Rock1表達水平較對照組和空載體組略有降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組與空載體組差異無顯著性(P>0.05)。而DADS作用LIMK1沉默組、對照組與空載體組后，Rock1表達明顯下調(diào)(P<0.05)，表明DADS可抑制Rock1表達。

圖7 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Rock1蛋白表達的作用1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS與BGC823, vector and miR-LIMK1比較，*P<0.05

2.8 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Cofilin1與p-Cofilin1蛋白表達的影響

結果顯示(圖8)，各組Cofilin1表達水平差異無顯著性(P>0.05)。但是，沉默組p-Cofilin1表達較對照組與空載體組明顯降低(P<0.05)，而DADS處理沉默組后p-Cofilin1表達顯著降低(P<0.05)。表明沉默LIMK1可抑制Cofilin1磷酸化，DADS能夠增強沉默LIMK1失活Cofilin1的作用。

圖8 DADS對LIMK1沉默BGC823細胞Cofilin1與p-Cofilin1表達的影響1:BGC823; 2:vector; 3:miR-LIMK1; 4:miR-LIMK1+DADS與BGC823 and vector比較，#P<0.05；與miR-LIMK1比較，*P<0.05

3 討 論

研究表明，Rac1/LIMK1/cofilin通路在許多疾病中起著一定作用。Tong等[7]報告，多形核中性粒細胞的過度募集和不當激活常導致炎癥性疾病。在中性粒細胞中，生理剪切應力誘導c-Abl激酶激活可調(diào)節(jié)Vav1的活性，進而影響Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin通路。Yang等[8]顯示，氯化鋁可下調(diào)Rac1、p-PAK、p-LIMK、p-cofilin，抑制F-actin的聚合滅活Rac1/cofilin通路，導致海馬區(qū)樹突棘的丟失。Lu等[9]報道，黃芩苷可上調(diào)SYP、PSD95、BDNF、TrkB表達，激活Rac1-LIMK1-cofilin通路，提高突觸可塑性，明顯減輕抑郁樣行為改變。

本研究結果顯示，沉默LIMK1可顯著抑制BGC823細胞遷移與侵襲，而DADS處理沉默組更為明顯。沉默組LIMK1 mRNA與蛋白表達明顯降低，DADS處理后，各組明顯低于處理前。LIMK1蛋白在對照組和空載體組細胞漿表達呈強陽性，在沉默組及DADS處理沉默組表達減弱，而DADS處理沉默組更為明顯。DADS作用后，沉默組、對照組和空載體組的Rac1、Rock1、Pak1與p-cofilin1表達均下調(diào)。表明DADS可通過阻斷Rac1/LIMK1/cofilin1通路增強沉默LIMK1抑制BGC823細胞遷移侵襲。

最近研究表明，HCC中長鏈非編碼RNA的分化拮抗非蛋白編碼RNA(long non-coding RNA differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR)高表達，促進肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而沉默DANCR可抑制移植瘤生長。DANCR作為ceRNA通過誘騙miR-27a-3p調(diào)節(jié)ROCK1/LIMK1/Cofilin1通路，促進HCC的發(fā)展與EMT[10]。Liao等[4]報告，LIMK1高表達通過激活體外PI3K/Akt信號通路促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與結直腸癌(CRC)移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，顯著增加細胞的增殖和遷移，而沉默LIMK1效果相反，表明LIMK1在促進CRC的進展起著關鍵作用。研究顯示，SSH3通過與LIMK1/Rac1的相互作用，調(diào)控參與細胞骨架信號通路的肌動蛋白的重構，進而促進CRC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。ROCK1和ROCK2可促進前列腺癌細胞PC-3和DU145細胞的增殖與遷移侵襲，沉默ROCK1和ROCK2可下調(diào)p-LIMK1和MMP-2表達，抑制前列腺癌細胞增殖和遷移[12]。Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-128-3p可靶向LIMK1調(diào)控LIMK1/CFL1通路抑制乳腺癌的進展。miR-138可顯著下調(diào)LIMK1與降低cofilin活性，抑制非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的遷移和侵襲，而LIMK1高表達的作用相反，提示miR-138可能通過靶向LIMK1/cofilin通路抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲[14]。在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)，miR-106a可直接靶向LIMK1抑制OSCC細胞的增殖與EMT[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-384可靶向并負調(diào)控LIMK1阻斷LIMK1/cofilin通路，抑制細胞增殖、侵襲、細胞周期、LNM與腫瘤生長和促進凋亡。

目前，研發(fā)LIMK/cofilin通路的抑制劑或藥物成為腫瘤治療的新途徑。Kang等顯示，骨橋蛋白(osteopontin, OPN)可促進NSCLC細胞遷移和侵襲。而從藥用植物白花梅根中分離的抗癌活性成分Plumbagin可可通過ROCK/LIMK/cofilin通路抑制OPN誘導的NSCLC細胞侵襲和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移[17]。研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物LC-0882可阻斷PAK4/LIMK1/cofilin通路抑制胃癌細胞的增殖與侵襲[18]。從草藥分離出曲霉醇可降低LIMK1活性和p-cofilin1抑制乳腺癌細胞遷移與F-actin聚合[19]。從苦參根中提取苦參堿下調(diào)EGFR磷酸化通過抑制EGFR/Cyclin D1/CDK4/6、EGFR/Akt和MEK-1/ERK1/2/MMP2通路，下調(diào)p-LIMK1和p-Cofilin抑制胃癌細胞遷移侵襲[20]。我們先前采用蛋白質(zhì)組學技術鑒定DADS作用胃癌細胞的靶點，發(fā)現(xiàn)LIMK1下調(diào)[21]。并且，DADS通過Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1/cofilin通路下調(diào)Rac1、ROCK1、PAK1、LIMK1與destrin以及p-LIMK1與p-cofilin 1，抑制結腸癌SW480細胞遷移與侵襲和裸鼠移植瘤生長[22-23]。DADS通過抑制PI3K/Akt通路抑制Rac1的表達和活性，從而抑制EMT和結腸癌細胞的遷移侵襲。進一步發(fā)現(xiàn)DADS通過靶向Rac1介導PAK1-LIMK1-Cofilins信號通路阻斷EMT[24]。本研究結果證實，DADS可通過阻斷Rac1/LIMK1/cofilin1通路增強沉默LIMK1抑制BGC823細胞遷移侵襲，表明Rac1可能是DADS抑制胃癌細胞侵襲的靶分子。