王博倫，顧豐穎，劉子毅，張 帆，劉 昊，楊婷婷，王 鋒*

（中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，農業(yè)農村部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

葉酸（folate）是一類水溶性的B族維生素，由蝶呤、對氨基苯甲酸和一個或多個谷氨酸組成（圖1），廣泛存在于果蔬和谷物中。葉酸是人體必需的微量營養(yǎng)素，有助于人體細胞分裂、分化與增殖，通過促進神經末梢的發(fā)育來保障人體神經系統(tǒng)的正常發(fā)育與運轉，在碳代謝循環(huán)、核酸的合成以及氨基酸的代謝中起著十分重要的作用[1-2]。目前，攝入人工合成葉酸是常用的葉酸補充途徑，但合成葉酸的過量攝入會引起一些并發(fā)癥[3-4]，諸如掩蓋VB12缺乏的初期表現、干擾機體對鋅的吸收和抗驚厥藥物發(fā)揮作用等。因此近些年天然強化葉酸食品越來越受到世界各國的重視。

圖 1 常見葉酸形式化學結構[7]Fig. 1 Chemical structure of folate[7]

食品是人體獲取膳食葉酸的主要來源。天然食品中的葉酸主要是以葉酸衍生物的形式存在[5]，最主要的天然葉酸形式包括[6]：5-甲酰四氫葉酸（5-formyltetrahydrofolate，5-HCO-H4PteGlun）、5-甲基四氫葉酸（5-methyltetrahydrofolate，5-CH3-H4PteGlun）、四氫葉酸（tetrahydrofolate，H4PteGlun）、葉酸（folic acid，PteGlun）（圖1）;不同葉酸衍生物又包含單谷氨酸形式和多聚谷氨酸形式的葉酸（表1），其中多聚谷氨酸通常包含2～14 個谷氨酸。天然食品中葉酸衍生物種類多，含量較低，而且不穩(wěn)定，容易在提取與測定過程中發(fā)生氧化降解或衍生物間相互轉化，在熱處理等條件下，5-HCO-H4PteGlun和5-CH3-H4PteGlun在轉化為10-甲酰四氫葉酸后（10-formyltetrahydrofolate，10-HCO-H4PteGlun），最終降解為蝶呤和對氨基苯甲酸，H4PteGlun在氧氣等作用下，直接降解為蝶呤和對氨基苯甲酸;不同食品樣品中基質差異較大，易受到干擾物質如有機酸、水溶性維生素和其他物質的影響;某些食品中的葉酸常以蛋白質或淀粉相結合的形式存在，結合態(tài)會影響測定的準確性;對于人體，5-CH3-H4PteGlun的生物活性最高，易被吸收且可直接利用于甲基化循環(huán)中，其他形式葉酸需在體內轉化為5-CH3-H4PteGlun后才可被利用（圖2），攝入豐富5-CH3-H4PteGlun的食品中更有利于人體補充葉酸[1]。因此，如何準確測定食品中總葉酸、PteGlun及其各種衍生物的含量一直是葉酸研究領域的關鍵問題，同時也是葉酸研究過程中的難點與重點。本文介紹了食品中葉酸的提取步驟，總葉酸、PteGlun及其衍生物含量測定的常見方法，為精準測定各種食品中的葉酸種類及含量提供參考。

圖 2 葉酸在體內代謝途徑[1]Fig. 2 Folate metabolism in the body[1]

表 1 食品中常見葉酸形式分類[7-8]Table 1 Folate forms commonly found in foods[7-8]

1 食品中葉酸的提取

食品中葉酸的分析測定包括葉酸的提取和儀器檢測兩方面。要建立穩(wěn)定可靠的葉酸測定體系，葉酸的提取十分重要，樣品中的PteGlun及其衍生物是否提取完全會直接影響測定結果的準確性。常用的葉酸提取與測定流程見圖3。葉酸對光較為敏感，在光照下尤其是在紫外照射的條件下會催化葉酸氧化，因此實驗操作都應在暗環(huán)境下進行，提取與測定過程中的玻璃器具應為棕色器具，盡量避免葉酸發(fā)生降解或衍生物間互相轉化。

圖 3 葉酸提取與測定的一般流程Fig. 3 General process of folate extraction and determination

1.1 樣品的浸提

樣品在粉碎過程應始終處于低溫環(huán)境，低溫可降低葉酸氧化損失速率。樣品研磨時可在球磨儀中加入液氮。粉碎后的樣品與提取液接觸時，內源酶活性會增強，可導致葉酸及其衍生物的降解或相互轉化，因此需立即進行沸水浴，使內源性酶失活。為避免提取過程中葉酸被氧化分解，提高提取與測定過程中葉酸的穩(wěn)定性，在提取液中加入質量濃度為10 g/L的抗壞血酸和體積分數為0.5%的β-巰基乙醇是目前常見方法[9]。Patring等[10]對樣品中的H4PteGlun進行了提取測定，評價了β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、2,3-二巰基-1-丙醇和2-硫代巴比妥酸4 種抗氧化劑對樣品中H4PteGlun的保護效果，結果表明毒性較低的2,3-二巰基-1-丙醇對H4PteGlun的保護效果優(yōu)于毒性較高的β-巰基乙醇，低毒且效果更優(yōu)抗氧化劑的應用前景更加廣泛;且緩沖液的選擇對葉酸的保護作用也有一定影響。前期本實驗室發(fā)現添加含硫化合物如大蒜素，也可以有效避免葉酸損失。

1.2 提取液的酶處理

酶處理是目前最常用的一種葉酸提取凈化方法，常使用α-淀粉酶、蛋白酶和葉酸軛合酶處理提取樣品。3 種酶對樣品處理時間、體系的溫度、pH值都會對提取效果產生很大影響[11]。根據酶的性質，酶解溫度通常設置為37 ℃或在室溫條件下，酶處理時間范圍為30～120 min。

葉酸會與食品中的蛋白質或淀粉結合，這種結合形態(tài)可增強葉酸在天然食品中的穩(wěn)定性，但不利于葉酸的分離提取。尤其對于淀粉含量較高的樣品，如玉米，在沸水浴滅酶后，樣品中淀粉會發(fā)生糊化現象，整個提取體系變得黏稠，無法進行后續(xù)提取步驟。因此需利用蛋白酶和淀粉酶兩種酶聯(lián)合處理樣品，水解基質中蛋白質與淀粉，使葉酸與蛋白質或淀粉分離，減少干擾物對測定準確性的影響。此操作是提取過程中十分關鍵的一步。

圖1葉酸化學結構中，谷氨酸與對氨基苯甲酸相連接，在天然食品中葉酸結構常常是幾個谷氨酸形成的多肽短鏈與對氨基苯甲酸相連接。多尾形式的葉酸在總葉酸中占有很大的比例，如三谷氨酸形式的葉酸和七谷氨酸形式的葉酸在食品中含量較高[12]。目前針對多尾形式葉酸的定量測定研究相對較少。測定食品中總葉酸含量的微生物法，其所使用的鼠李糖乳桿菌只可測定出單尾形式的葉酸或含2～3 個谷氨酸尾的葉酸，對長鏈的谷氨酸葉酸衍生物的響應會低很多[13]。一般在測定總葉酸含量或各葉酸衍生物含量時，通常使用葉酸軛合酶將多尾形式葉酸轉化為單尾形式的葉酸以保證測定結果的準確性。常使用的葉酸軛合酶如大鼠血清、雞胰臟和豬腎臟等[10]，大鼠血清由于其方便制備、易購買且其內源性葉酸易被清除而被廣泛使用。

相關研究表明，蛋白酶、淀粉酶以及葉酸軛合酶的使用，可釋放與蛋白質或淀粉結合的葉酸，轉化多尾形式葉酸為單尾形式葉酸，實現準確測定富含淀粉或蛋白食品中的葉酸含量[14]。許多研究已將酶解運用到微生物法[15-16]和色譜法[17-18]測定葉酸的前處理環(huán)節(jié)。Martin等[19]在用微生物法測定食品中的葉酸含量時，同時使用蛋白酶、α-淀粉酶與軛合酶處理樣品，測得的葉酸含量顯著增加（最高達51%）;Aiso等[15]研究發(fā)現，采用三酶處理后，葉酸含量提升50%以上;Pandrangi等[20]運用微生物法測定菠菜中的葉酸含量，優(yōu)化加酶量及pH值條件，葉酸測定量顯著提高。但三酶處理并不是對所有樣品均適用。對于蛋白或者淀粉含量低的樣品，僅僅添加葉酸軛合酶處理樣品便可;若添加蛋白酶或淀粉酶可能會導致樣品提取液中的葉酸含量測量值偏低，會對測定結果產生負面影響[21]。Iwatani等[22]研究結果表明，三酶共同處理蔬菜類樣品后，葉酸含量測定值會有所降低。Zhang Heng等[23]實驗結果表明，有無使用蛋白酶和淀粉酶對樣品進行處理，其測定的葉酸含量基本一致。3 種酶是否添加及添加量需要依據樣品中干擾物質含量進行優(yōu)化，如淀粉含量較高的谷物類，需增大淀粉酶含量，適當減少或不加入蛋白酶。

1.3 葉酸衍生物的形態(tài)轉化

在提取的過程中，Ndawa等[8]在測定前將食品中的PteGlun、5-HCO-H4PteGlun、H4PteGlun等葉酸衍生物簡單、快速的轉化為5-CH3-H4PteGlun。這種方法可減少對各種葉酸衍生物的單獨分析過程，更快速地測定總葉酸含量，為測定總葉酸提供了新的思路。選擇轉化為5-CH3-H4PteGlun基于如下原因：5-CH3-H4PteGlun在酸性介質中較為穩(wěn)定，且其具有天然熒光性，對液相色譜（liquid chromatography，LC）熒光檢測器響應值高。此外，通過幾種化學反應途徑能夠將PteGlun、5-HCOH4PteGlun和10-HCO-H4PteGlun轉化為5-CH3-H4PteGlun。對未經解離的多谷氨酸形式葉酸此種轉換也很重要，可測得樣品中最初存在的不同尾數多谷氨酸形式葉酸含量，便于分析食品中葉酸的種類。

1.4 提取液的純化

樣品的純化是為了去除樣品中蛋白質、淀粉水解產物等雜質，防止雜質干擾測定，同時富集樣品中的葉酸，使各種樣品葉酸提取液中葉酸含量在檢測限以上。對葉酸研究分析中常使用固相萃取（solid-phase extraction，SPE）或固定化葉酸結合蛋白親和色譜[24]對樣品進行凈化。SPE是最常用的葉酸純化方法，通常使用強陰離子交換（strong anion exchange，SAX）固相萃取柱或C18固相萃取柱進行提取液的純化[25-26]。Jastrebova等[27]運用SAX凈化甜菜根葉酸提取液，凈化效果明顯，H4PteGlun回收率可達98.8%，5-CH3-H4PteGlun回收率可達103.6%，5-HCO-H4PteGlun回收率可達95.4%。葉酸結合蛋白親和色譜也可用于樣品提取液純化[28]，葉酸結合蛋白親和色譜特異性好，對PteGlun的結合能力強，回收率在78%以上[29]。但葉酸結合蛋白對5-HCO-H4PteGlun的親和力較低，這可能導致在純化步驟期間5-HCO-H4PteGlun的損失[30]。Zhang Guofang等[31]用簡單且快速的超濾代替了固相萃取或親和柱純化葉酸的方法，在提取液進行酶解、離心取上清液后，使用5 kDa截留膜超濾，除去植物提取物中存在的大部分聚合物。相關數據也表明葉酸不會殘留在膜上。此法與耗時的親和色譜及SPE凈化相比，更加簡單、省時，但在LC前處理環(huán)節(jié)不太適用。

2 葉酸測定方法研究進展

在過去幾年中，用于測定各種天然食品基質中存在的不同形式的葉酸的分析技術取得一定進展[6,32-36]。我國測定食品中葉酸含量的標準方法為微生物法，其適用范圍較廣，可測定樣品中總葉酸含量，但無法單獨測定不同葉酸衍生物含量。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法彌補了這一缺點，可應用于測定食品中的PteGlun、5-HCO-H4PteGlun、5-CH3-H4PteGlun等葉酸衍生物的含量。液相色譜與質譜聯(lián)用技術測定食品中的葉酸近幾年也開始快速發(fā)展，其優(yōu)點是能同時快速測定出數種葉酸形式及不同尾數谷氨酸形式葉酸含量。熒光和電化學技術測定葉酸的發(fā)展也十分快速。

2.1 微生物法

微生物法測定結果代表食品中總葉酸含量。通常所用的微生物有鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）及糞鏈球菌Streptococcus faecalis（ATCC 8043）。國家標準中選用的微生物為鼠李糖乳桿菌。其原理為：葉酸是鼠李糖乳桿菌的生長必需物質，培養(yǎng)基中如果缺乏葉酸則鼠李糖乳桿菌不能生長。在此法中，鼠李糖乳桿菌的生長程度與培養(yǎng)基中所含有的葉酸量成正比關系，通過對培養(yǎng)基透光率的測定，根據葉酸含量與透光率的標準曲線即可計算出樣品中總葉酸的含量[37]。此方法可適用于各類食品中葉酸的測定，并且靈敏度高，當樣品中被測物量極少時，亦能測出;當測定樣品為果蔬時，檢出限與定量限最低，檢出限為0.2 g/100 g，定量限為0.4 g/100 g。此法原理明確，操作較為簡單，不需要復雜設備及儀器，因而被廣泛應用。在最新的第17版Association of Official Analytical Chemists（AOAC）分析方法中，食品中葉酸的第一分析方法為微生物法;許多發(fā)達國家在分析食品營養(yǎng)成分時，也采用微生物法測定葉酸含量。微生物法具有較高的靈敏度，但也存在實驗周期長，實驗步驟繁瑣，結果重復性差等局限性;而且此法測定的葉酸含量為單尾形式葉酸、二尾形式葉酸和三尾形式葉酸的總和，不能分別測定不同形態(tài)葉酸的含量。同時，生物體對不同葉酸形態(tài)的響應并不總是相同的，如糞鏈球菌只能利用PteGlun、二氫葉酸（dihydrofolate，H2PteGlu）、H4PteGlun，測定時會導致一定的誤差。這也是微生物法正逐漸被其他簡便、快速、準確的方法替代的主要原因[11]。

2.2 高效液相色譜法

HPLC法可準確測定食品中PteGlun及其各種衍生物的含量。Englehardt等[38]率先開展液相色譜測定葉酸的研究，此后，液相色譜技術分析測定食品中的葉酸得到了迅速發(fā)展[39-40]。近年來，液相色譜法定性定量分析樣品中葉酸已變得十分普遍?；诓煌螒B(tài)葉酸與色譜柱親和能力的差異，利用流動相對目標物進行梯度洗脫，可將樣品中H4PteGlu、5-CH3-H4PteGlu、5-HCO-H4PteGlu、10-CHO-H4PteGlu、H2PteGlu、PteGlu等分離。

檢測器方面可使用紫外[41]、熒光檢測器[42-43]和二極管陣列檢測器[44]等。目前測定PteGlu、5-HCO-H4PteGlu常用紫外檢測器，其選擇性好、靈敏度高;測定5-CH3-H4PteGlun時，因其具備天然熒光性，常使用熒光檢測器，熒光檢測器具備更低的檢測限，特別對復雜組分樣品中葉酸檢測方面更顯示其優(yōu)越性。郭麗瓊等[45]利用高效液相熒光檢測法測定柑橘中5-CH3-H4PteGlu的含量，檢測限為0.01 ng/mL。張毅[46]運用HPLC二極管陣列檢測器測定葉菜中PteGlu和5-CH3-H4PteGlu含量，PteGlu檢測限可低至2.3 ng/mL，定量限為10.0 ng/mL;5-CH3-H4PteGlu檢測限為0.1 ng/mL，定量限為0.3 ng/mL。

液相色譜法可對樣品提取液中的各類葉酸及其衍生物進行分析，并且測定效果好，操作簡便，近年來得到了廣泛的認可[47]。但不足是LC法通常缺乏LC串聯(lián)質譜法（LC-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測定所具備的特異性、更高的靈敏度以及穩(wěn)定性，對提取液凈化程度要求較高。

2.3 液相色譜串聯(lián)質譜法

LC-MS/MS法能夠測定食品中不同尾數的多聚谷氨酸形式的葉酸和不同形式的葉酸衍生物。已報道許多使用LC-MS/MS測定不同產品中葉酸的方法[48-50]。劉進璽等[51]使用LC-MS/MS測定樣品中葉酸，在正離子選擇反應監(jiān)測模式下進行，以乙腈-0.1%甲酸溶液（5∶95，V/V）為流動相，流速為0.25 mL/min，色譜柱溫度40 ℃，進樣量2 μL;結果表明：回收率80.7%～89.7%，相對標準偏差2.90%～3.85%，檢出限1 ng/mL，線性范圍0.001～1.000 μg/mL。戴金鳳等[52]用HPLC-MS/MS測定了四棱豆中不同尾數的多聚谷氨酸形式的葉酸的含量，各種葉酸衍生物的檢測限范圍為40～1 133 fmol，定量限范圍為120～3 400 fmol，且發(fā)現四棱豆中多聚谷氨酸形式的葉酸的主要形式是五谷氨酸尾葉酸，占葉酸總量的65%;其次是單谷氨酸葉酸占30%。Tyagi等[30]用HPLC-MS/MS測定了番茄中不同葉酸衍生物的含量，PteGlu的檢測限為0.15 ng/mL，H4PteGlu檢測限為0.25 ng/mL，5-CH3-H4PteGlu檢測限為0.17 ng/mL，5-HCO-H4PteGlu檢測限為0.37 ng/mL;PteGlu的定量限為0.47 ng/mL，H4PteGlu的定量限為0.77 ng/mL，5-CH3-H4PteGlu的定量限為0.53 ng/mL，5-HCO-H4PteGlu的定量限為1.12 ng/mL。HPLC-MS技術的靈敏度較高，檢測周期短，可測定不同的多聚谷氨酸葉酸形式及含量[53]，并且樣品預處理簡單，但是質譜的優(yōu)勢在于定性，在定量準確性方面低于LC，同時設備較貴。

2.4 熒光法

熒光法可測定食品或復合維生素制劑中PteGlu的含量。PteGlu具有特殊的吸收光譜特性，紫外光可將其轉變?yōu)闊晒饣衔铩２⑶襊teGlu的熒光強度與其含量成正比關系，此方法可用作PteGlu的定量。

邵麗華等[54]用質量分數0.04%的高錳酸鉀對樣品進行氧化，在370 nm激發(fā)波長，443 nm發(fā)射波長處用使用間接熒光法對小米中PteGlu含量進行了測定，該法操作簡單，且靈敏度高，重復性好。秦立俊[55]利用熒光法和間接原子吸收光譜法測定PteGlu，其線性范圍為0～1.6 μg/mL，檢出限為0.051 μg/mL，平均加標回收率為97.1%。郭健等[56]利用熒光分光光度計測定食品中的PteGlu，檢出限為0.05 μg/mL。熒光法目前無法同時分別測定樣品中葉酸及其衍生物的含量。

2.5 電化學法

近年來，在PteGlu的測定上，電化學法優(yōu)勢更加凸顯，與傳統(tǒng)方法相比，此方法的分析時間相對較短，靈敏度高，準確度高，成本低，檢測限低，非常適用于制藥、食品和農業(yè)領域的應用[57-58]。

趙玲[59]研究了PteGlu在鉑納米顆粒/多壁碳納米管修飾玻碳電極上的電化學行為。采用差分脈沖法，測得還原峰電流與PteGlu濃度在2.0×10-7～1.0×10-4mol/L呈線性，線性相關系數r=0.997，檢出限為5.01×10-8mol/L，并且將此法成功運用到葉酸片、菠菜、牛奶中的PteGlu定量測定。杜學萍[60]運用基于聚中性紅/多壁碳納米管修飾玻碳電極測定PteGlu含量，電化學傳感器上的電流與樣品中PteGlu含量與在6.25×10-7～5.00×10-5mol/L之間呈現良好的線性關系，檢出限為1.37×10-7mol/L，相關系數r=0.998 6。實驗回收率在99.3%～103.2%。此方法中電極制備操作簡單，穩(wěn)定性高，具有一定的推廣性。

電化學法在測定中不需要分離提純，可以直接測定，受到很多分析工作者的追捧。電化學傳感器對PteGlu的測定十分靈敏，并且近年來研究人員發(fā)現修飾電極具有更高的電化學性能、更高的靈敏度和選擇性。調整修飾電極的尺寸和形態(tài)使得電化學裝置小型化，加速了電化學法在PteGlu測定領域的應用與推廣[61-62]。但是目前多數測定方法針對目標僅為PteGlu，對其他形式的葉酸測定文獻報道較少。

通過表2對比各檢測方法，微生物法測定葉酸操作簡單，成本低，測定結果較為靈敏，但不足為實驗周期較長，測定結果只能代表樣品中的總葉酸含量，無法分別測定PteGlun及其衍生物含量;目前常用的HPLC法測定結果靈敏度高，也可分別定量樣品中葉酸及其衍生物，熒光檢測器對5-CH3-H4PteGlun測定優(yōu)勢明顯;LC-MS/MS可簡便快速地定性樣品中葉酸及其衍生物，但相對液相色譜其準確定量要差些，而且檢測成本較高;熒光和電化學檢測方法針對的葉酸形式較為單一，其并不能用于所有葉酸衍生物。

3 結 語

葉酸缺乏癥在全世界被公認為一個保健問題，越來越多的人重視葉酸的攝入量;為保障葉酸的有效攝入量，有必要測定食品中不同形態(tài)葉酸衍生物的含量。本文概述了食品樣品中葉酸含量測定的常見前處理步驟及方法，對比了各種葉酸測定方法的優(yōu)劣。在提取環(huán)節(jié)，由于食品基質復雜，尤其是谷物基質和復配食物，提取液的純化難度較大，加之葉酸天然的不穩(wěn)定性，樣品中葉酸的無損提取一直是葉酸分析測定的難點;在測定環(huán)節(jié)中，由于葉酸形態(tài)多樣，微生物法、HPLC、LC-MS/MS、熒光和電化學檢測法對葉酸的測定各有利弊，因此需要根據不同測定目的和測定目標，選用適宜檢測方法。隨著分離提純以及檢測技術的不斷發(fā)展，相信食品中葉酸的精準測定方法會得到了更多的關注。

表 2 各種葉酸測定方法對比Table 2 Comparison of folate detection methods