張琦敏，倪娓娓，張 欣，李 穎，馬向陽，楊佳杰，李 春，李曉東，李艾黎*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

母乳作為嬰兒出生后6 個(gè)月內(nèi)的完全營養(yǎng)來源，其生物功能與嬰兒健康息息相關(guān)。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國兒童基金會(huì)建議，在出生后最初6 個(gè)月以純母乳喂養(yǎng)嬰兒，并持續(xù)母乳喂養(yǎng)至2 周歲以上。母乳成分對(duì)嬰幼兒降低感染和促進(jìn)嬰幼兒消化道（尤其是腸道）屏障分化成熟的作用已經(jīng)得到了數(shù)十年的研究和探索。近年來，隨著人們對(duì)先天免疫機(jī)制的不斷認(rèn)識(shí)，母乳成分對(duì)多種嬰幼兒疾病的治療作用和對(duì)腸道屏障的保護(hù)和促進(jìn)作用得到了進(jìn)一步研究。

腸道屏障是人體與外部環(huán)境接觸較為廣泛的一個(gè)部分（面積達(dá)200～300 m2），通過組織、細(xì)胞和信號(hào)分子對(duì)整個(gè)機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)起作用，對(duì)宿主防御至關(guān)重要。腸道屏障可分為先天免疫和適應(yīng)性免疫兩大類。其中先天免疫是在嬰兒出生時(shí)就存在的，能夠起到部分免疫作用;而適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在嬰兒時(shí)期尚未成熟，需要后天的免疫反應(yīng)不斷形成記憶。如圖1所示，腸道屏障可分為3 個(gè)主要組成部分：腸腔內(nèi)分泌黏液層、腸上皮細(xì)胞層和固有層。由杯狀細(xì)胞分泌的含抗菌活性蛋白的黏液構(gòu)成黏液層，提供潤滑和阻隔作用，減少表層與共生細(xì)菌的接觸[1];腸上皮細(xì)胞層由腸上皮層吸收性細(xì)胞、微皺褶細(xì)胞（M細(xì)胞）、杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞4 種高度分化的腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）構(gòu)成。IEC層位于黏液層之下，形成一個(gè)由連接蛋白固定的物理屏障，能夠在腸道病原體的刺激下啟動(dòng)細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄，通過釋放細(xì)胞因子和趨化因子，隨后吸引白細(xì)胞，產(chǎn)生防御反應(yīng);固有層含有許多天然免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等[2]，其作用包括抗原的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)、誘導(dǎo)T細(xì)胞分化、刺激免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）的產(chǎn)生和組織修復(fù)。

圖 1 腸道屏障的主要結(jié)構(gòu)Fig. 1 Main structure of the intestinal barrier

嬰幼兒腸道屏障的建立和成熟對(duì)后天的健康有巨大影響。新生兒從子宮進(jìn)入外界環(huán)境并接觸抗原，迫使胃腸道迅速適應(yīng)，并履行其免疫職責(zé)。但是新生兒的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，不能發(fā)揮特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。母乳的獨(dú)特成分構(gòu)成涵蓋了嬰兒在出生后6 個(gè)月內(nèi)的所有營養(yǎng)和免疫發(fā)育需求。因此，眾多學(xué)者針對(duì)母乳成分對(duì)嬰兒腸道屏障的影響及其機(jī)制展開了廣泛而深入的研究?；诖?，本文綜述母乳中的多種生物活性成分在嬰幼兒先天免疫和腸道屏障發(fā)育中的作用機(jī)制。

1 母乳低聚糖

母乳低聚糖（human milk oligosaccharide，HMO）是由短鏈和長(zhǎng)鏈寡糖結(jié)構(gòu)構(gòu)成的一類復(fù)雜的非共軛聚糖，是人乳中第三大固體成分。人初乳中HMO含量約為20～25 g/L，隨著成熟穩(wěn)定至10～15 g/L，超過蛋白質(zhì)的總量，比牛乳中低聚糖的濃度高出100～1 000 倍[3]。HMO由5 種單糖組成：半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）和唾液酸。所有HMO均攜帶一個(gè)乳糖（Galβ1-4Glc）殘基，以β-1,3或β-1,6-鍵連接Galβ1-3 GlcNAc（1型鏈）或Galβ1-4 GlcNAc（2型鏈）。HMO的基本結(jié)構(gòu)是巖藻糖基化和或唾液酸化，分別在短鏈寡糖結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)鏈寡糖結(jié)構(gòu)中形成中性和酸性低聚糖，對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。其中，2’-巖藻糖乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）被認(rèn)為是含量最豐富的低聚糖，其質(zhì)量濃度為0.06～4.65 g/L。

自2016年歐盟批準(zhǔn)2’-FL與乳糖-N-新四糖兩種HMO作為食品成分以來，關(guān)于HMO在嬰兒體內(nèi)的生物功能等研究得到了廣泛的關(guān)注。已有綜述描述了HMO作為益生元促進(jìn)擬桿菌屬和雙歧桿菌屬的嬰兒腸道環(huán)境內(nèi)定植[4]，防止致病菌感染的功能[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，HMO在促腸道上皮層成熟及調(diào)節(jié)免疫分子表達(dá)中也具有重要的生物功能。因此，HMO在促進(jìn)嬰兒腸道屏障功能中發(fā)揮重要作用。

1.1 HMO促進(jìn)腸上皮層成熟

HMO具有調(diào)節(jié)IEC凋亡、增殖和分化的作用[6]，同時(shí)可以改變腸上皮細(xì)胞基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞表面糖原的改變[7]。HMO與IEC表面或向腸腔突出的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）表面的聚糖相互作用，促進(jìn)腸上皮屏障的成熟;或者通過調(diào)節(jié)微生物群和隨后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸間接影響屏障的完整性[8]。并且，暴露于HMO能夠促進(jìn)黏膜成熟因子在胎兒腸培養(yǎng)物中的表達(dá)。這些結(jié)果表明，HMO可能促進(jìn)腸道成熟，并有助于新生兒胃腸道上皮屏障的完整性。

1.2 HMO影響免疫信號(hào)分子

除直接調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞分化成熟外，HMO干預(yù)先天免疫的分子機(jī)制也得到了廣泛的研究。其中，HMO介導(dǎo)凝集素受體和Toll樣受體干預(yù)免疫為解釋HMO的免疫影響提供了重要的參考。

1.2.1 HMO干預(yù)凝集素信號(hào)

凝集素是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的重要生物信息分子，能夠特異地與部分HMO結(jié)合而激活或抑制，從而影響凝集素功能和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素（sialic acid-binding Ig-like lectins，Siglecs）是一類細(xì)胞表面受體，可識(shí)別多種細(xì)胞表面糖結(jié)合物的唾液酸殘基。Siglecs通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，抑制細(xì)胞活化和增殖，降低免疫細(xì)胞功能;并通過影響B(tài)淋巴細(xì)胞，抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能。唾液酸化的HMO能夠通過結(jié)合Siglecs降低其信號(hào)，參與免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制如圖2所述。Koliwer等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Siglecl-4（髓蛋白相關(guān)糖蛋白）與α2,3-唾液酸基乳糖發(fā)生結(jié)合，而Siglecl-2（CD22）則與α2,6-唾液酸基乳糖相互作用[9]。

具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)功能的凝集素還包括半乳糖凝集素（galectins）家族，是由胃腸道免疫細(xì)胞和人胃腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的糖結(jié)合蛋白。其信號(hào)通過與β-半乳糖基的低聚糖的結(jié)合發(fā)生變化，參與多種生理和病理過程，包括調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和炎癥。因此含β-半乳糖基的HMO作為配體結(jié)合半乳糖凝集素調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的分子機(jī)制可能作為HMO調(diào)節(jié)嬰幼兒先天免疫的另一方向。de Kivit等報(bào)道低聚半乳糖能夠通過激活galectin-9驅(qū)動(dòng)輔助性T細(xì)胞1（helper T cell，Th1）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）極化（通過干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10介導(dǎo)的反應(yīng)），參與調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)[10]。Noll等開發(fā)多糖微陣列鳥槍法進(jìn)行天然母乳聚糖（包含HMO及非HMO多糖）的糖組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與galectin（-1、-2、-3、-4、-7、-8、-9）能夠特異性識(shí)別和結(jié)合[11]。在Kitova等的研究中，galectin-3被證明可以從HMO混合物中識(shí)別配體，包括3-唾液酸乳糖、乳糖-N-巖藻戊糖（lacto-N-fucopentaose，LNFP）和乳糖-N-二巖藻己糖[12]。但HMO調(diào)節(jié)凝集素信號(hào)分子介導(dǎo)的生物功能尚未有明確闡釋。

圖 2 唾液酸化糖復(fù)合物影響Siglecs信號(hào)Fig. 2 Sialylated glycoconjugate affects siglecs signaling

另外，以DC特異性細(xì)胞間黏附分子-3-非整合素（dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN）為代表的c型凝集素能夠結(jié)合HMO，直接與DC相互作用。如2’-FL和3’-FL可以通過與DC-SIGN、凝集素和相關(guān)的聚糖結(jié)合蛋白特異性結(jié)合與DC直接相互作用，因此引導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)向有效的免疫識(shí)別和清除病原體方向發(fā)展[11]。

1.2.2 HMO干預(yù)Toll樣受體通路信號(hào)

HMO調(diào)節(jié)免疫的機(jī)制還表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)表達(dá)中。TLR受體家族由11 個(gè)成員組成，在進(jìn)化歷程中高度保守，在免疫反應(yīng)中起到重要作用。TLRs通過激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等炎癥信號(hào)通路和干擾素調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致促炎因子的分泌，引發(fā)級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)。TLR在人胎腸上皮細(xì)胞中過表達(dá)，且TLR負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因表達(dá)不足。因此，胎兒組織未成熟的腸黏膜容易對(duì)促炎刺激反應(yīng)過度，增加?jì)雰耗c炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

如圖3所示，特定的HMO結(jié)構(gòu)已經(jīng)被證實(shí)可以調(diào)節(jié)TLR表達(dá)，如唾液酸內(nèi)酯、半乳糖基乳糖或LNFP III可能是TLR的配體。例如，TLR-3信號(hào)似乎被α3-半乳糖基HMO特異性抑制，3’-FL、2’-FL能夠調(diào)節(jié)TLR-3并產(chǎn)生抗炎作用;此外，2’-FL通過抑制TLR-4緩解炎癥反應(yīng)[14]。

圖 3 調(diào)節(jié)TLRs的母乳成分[14-20]Fig. 3 Human milk components that modulate Toll-like receptors[14-20]

2 母乳脂質(zhì)

傳統(tǒng)意義上，乳脂提供了嬰兒所需50%的熱量，是母乳中主要的供能物質(zhì)[21]。母乳是一種天然的水包油乳劑，而乳脂肪球（milk fat globule，MFG）是其中一個(gè)重要的組分，因其高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和變量組成在嬰兒配方奶粉中難以合成。母乳脂肪球的成分和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，在嬰兒免疫發(fā)育、新陳代謝和消化吸收過程中具有重要的生物活性，近50余年來，學(xué)者們圍繞其結(jié)構(gòu)、形成路徑和功能開展了大量的研究。近年來，許多動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)了母乳脂肪球和長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸在腸道屏障功能方面的重要作用。

2.1 母乳脂肪球膜

MFG的形成始于三?；视停╰riacylglycerols，TAGs）構(gòu)成的乳脂微粒，乳脂微粒從乳腺肺泡上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過泌出，形成包圍磷脂單層的胞質(zhì)脂滴（cytoplasmic lipid droplets，CLD）。遷移CLD的上皮細(xì)胞以胞吐的形式將其傳遞到母乳中，同時(shí)為CLD進(jìn)一步增加外圍雙分子層，形成成熟的脂肪球膜（membrane of MFG，MFGM）。

MFGM含有多種成分（主要是極性脂類、蛋白質(zhì)、中性脂類和RNA等微量成分），其功能是將油脂穩(wěn)定為乳化的小脂肪球。MFGM的主要組成部分是膜磷脂，即甘油磷脂，包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇[22]，以及鞘磷脂（sphingomyelin，SM）[23]。

SM是MFGM中占主導(dǎo)地位的鞘脂類物質(zhì)，與奶畜乳相比，SM在人乳中的含量要高得多。在嬰幼兒消化道中，SM消化產(chǎn)生神經(jīng)酰胺、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）。這些化合物都是鞘脂類合成和降解過程中的代謝中間體，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和免疫細(xì)胞遷移等生物活性。如神經(jīng)酰胺是細(xì)胞內(nèi)通路介導(dǎo)的具有多種信號(hào)功能的生物活性化合物;S1P是質(zhì)膜G蛋白的良好偶聯(lián)受體。

2.1.1 母乳脂肪球膜促進(jìn)腸道上皮層發(fā)育

母乳脂肪在促進(jìn)新生兒腸道發(fā)育中有重要價(jià)值，它提供細(xì)胞膜基本結(jié)構(gòu)和作為細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)分子在腸道屏障中遷移[24]。其中，MFGM在促進(jìn)腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育和腸道上皮細(xì)胞分化中起到重要作用。Motouri等報(bào)道添加MFGM類似物的配方奶粉在幼鼠腸道中改善上皮細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而加速腸道發(fā)展和改善腸道黏膜結(jié)構(gòu)，對(duì)緊密連接蛋白的表達(dá)水平方面的影響與母鼠飼養(yǎng)的幼鼠相似[25]。Snow等的研究表明，在斷奶后給小鼠喂食富含MFGM的食物，可以通過加強(qiáng)黏膜屏障防止脂多糖誘導(dǎo)的腸道炎癥[26]。

MFGM是極性脂質(zhì)載體，其消化產(chǎn)物對(duì)新生兒腸的形態(tài)和功能發(fā)育至關(guān)重要。MFGM是神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)入新生兒腸道的唯一來源，降低幼鼠腸細(xì)胞膜膽固醇與神經(jīng)節(jié)苷脂的比值[27]。神經(jīng)節(jié)苷脂可以被腸黏膜吸收利用，并起到改變膜的流動(dòng)性和腸細(xì)胞的通透性的生物功能，修飾IEC的刷狀緣[27]。對(duì)剛斷奶的幼鼠進(jìn)行神經(jīng)節(jié)甘脂飲食干預(yù)時(shí)觀察到腸道上皮細(xì)胞的形態(tài)變化[28]。神經(jīng)節(jié)苷脂可以阻止炎癥前刺激破壞腸細(xì)胞間緊密連接的完整性，給大鼠喂食神經(jīng)節(jié)苷脂可以防止脂多糖刺激細(xì)胞導(dǎo)致緊密連接蛋白的減少[29]，對(duì)于控制腹瀉、感染、過敏原滲透和營養(yǎng)不良非常重要。

MFGM在調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子方面也具有生物活性。神經(jīng)節(jié)苷脂可通過降腸道細(xì)胞的膽固醇含量[30]，破壞膜微區(qū)結(jié)構(gòu)，抑制促炎因子的生成。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)節(jié)苷脂被報(bào)道抑制炎癥激活的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1β高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中也有類似的結(jié)果，神經(jīng)節(jié)苷脂在低氧條件下，可減少體外培養(yǎng)暴露于脂多糖的嬰兒腸道中IL-6和IL-8的生成。

MFGM對(duì)腸道屏障發(fā)育的功能還表現(xiàn)在SM及其代謝產(chǎn)物對(duì)嬰兒腸道血管系統(tǒng)的促進(jìn)功能，以滿足胃腸道發(fā)育時(shí)期的高代謝需求，從循環(huán)方面影響腸道的成熟。其中，S1P在血管系統(tǒng)發(fā)育中的作用已經(jīng)得到了較廣泛的研究。例如，S1P激活A(yù)kt信號(hào)通路通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形態(tài)發(fā)生啟動(dòng)血管生成[31]，并通過上調(diào)黏附連接增加血管屏障功能。

2.1.2 母乳脂肪球膜調(diào)節(jié)固有層細(xì)胞免疫

SM及其代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)免疫信號(hào)分子及細(xì)胞免疫中的重要價(jià)值已經(jīng)被部分研究證實(shí)。在細(xì)胞免疫過程中，B細(xì)胞產(chǎn)生IgA的過程受到S1P信號(hào)和S1P受體1（S1P receptor-1，S1P1）的調(diào)控表達(dá);參與產(chǎn)生先天免疫系統(tǒng)非特異性抗體的腹膜B1細(xì)胞需要S1P和S1P1的結(jié)合才能遷移到腸道上皮細(xì)胞;上皮內(nèi)T淋巴細(xì)胞某些亞型的出現(xiàn)依賴于S1P;S1P還參與T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞的遷移[32]（T細(xì)胞遷移過程見圖4）。因此S1P與新生兒的腸道免疫成熟密切相關(guān)，有助于改善新生兒（尤其是早產(chǎn)兒）淋巴細(xì)胞過少、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能不全的細(xì)胞免疫環(huán)境[33]，但目前鮮有報(bào)道證實(shí)母乳中SM代謝產(chǎn)生的S1P能夠直接改善新生兒腸道免疫。

圖 4 S1P/S1P1在T細(xì)胞遷移中的作用[34]Fig. 4 Role of sphingosine-1-phosphate (S1P)/S1P receptor-1 in T cell migration[34]

不同于SM和糖基神經(jīng)酰胺依賴于膽鹽進(jìn)行溶解，神經(jīng)節(jié)苷脂由于其唾液酸含量高，可直接溶于水并形成混合膠束，并可能穿透黏液層，與病原體和刷狀緣相互作用。神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)免疫成熟的影響，表現(xiàn)在對(duì)T細(xì)胞分化和IgA表達(dá)的影響，對(duì)脂多糖引起的腸炎癥和壞死（如新生兒壞死性結(jié)腸炎）具有保護(hù)作用[35]。

2.2 多不飽和脂肪酸

TAG的主要水解產(chǎn)物為脂肪酸，其生理功能主要由必需脂肪酸和長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFA）體現(xiàn)，即亞油酸（C18:2n-6）和α-亞麻酸（C18:3n-3）的伸長(zhǎng)和進(jìn)一步去飽和衍生物。人乳n-6側(cè)的主要定量LC-PUFA為亞麻酸（C20:3n-6）和花生四烯酸（C20:4n-6）（arachidonic acid，AA），對(duì)應(yīng)的n-3側(cè)為二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）（C20:5n-3）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）（C22:6n-3）。

LC-PUFA（特別是AA與EPA）能夠調(diào)節(jié)臍帶血細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TLR功能，干預(yù)嬰幼兒先天免疫。LC-PUFA對(duì)炎癥和免疫的影響有兩種機(jī)制——細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變和二十烷酸生產(chǎn)的調(diào)節(jié)，兩者都是由炎癥和免疫細(xì)胞膜內(nèi)磷脂的脂肪酸組成的改變驅(qū)動(dòng)的。首先，EPA和DHA的高度不飽和性質(zhì)意味著它們有可能對(duì)免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜秩序產(chǎn)生顯著影響?；ㄉ嵫苌?，即類二十烷酸，在炎癥和免疫細(xì)胞中起到炎癥信號(hào)分子的功能，一些脂肪酸影響免疫細(xì)胞的反應(yīng)可能是由于影響類二十烷酸的產(chǎn)生。EPA和DHA被免疫細(xì)胞利用的過程會(huì)消耗AA，因此就降低了激活炎癥和免疫調(diào)節(jié)的類二十烷酸底物含量，以此減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)[36]。

3 母乳蛋白

母乳蛋白大致可分為三大類：酪蛋白、乳清蛋白和黏蛋白（mucins，MUC）。酪蛋白和乳清蛋白在泌乳過程中所占比例最大，而MUC多為脂肪球膜蛋白，在母乳中所占比例較小。人乳蛋白在嬰幼兒體內(nèi)除了營養(yǎng)作用外，還發(fā)揮多種生理功能，如促進(jìn)脂肪和碳水化合物吸收、參與免疫功能、降低感染、參與激素調(diào)節(jié)等。酪蛋白和乳清蛋白在嬰兒消化道內(nèi)會(huì)發(fā)生水解，產(chǎn)物活性肽具有多種生物活性。關(guān)于母乳活性肽的功能特性已經(jīng)有數(shù)十年的研究歷史，其對(duì)腸道屏障及先天免疫的影響已經(jīng)得到較深入的認(rèn)識(shí)[37]，此外，乳鐵蛋白作為母乳中主要的抗菌物質(zhì)，其在嬰兒免疫反應(yīng)中的功能和作用機(jī)制已有文獻(xiàn)進(jìn)行綜述[38-39]。而近年來，以骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、乳凝集素、細(xì)胞因子和MUC等為主的活性蛋白對(duì)嬰兒腸道屏障功能的影響逐漸得到關(guān)注和認(rèn)可，在下文中將對(duì)其影響腸道屏障的功能及機(jī)制進(jìn)行綜述。

3.1 骨橋蛋白

OPN是一種參與生理和病理生理過程的分泌蛋白，在人體腎、腦、骨髓、內(nèi)皮細(xì)胞等組織中大量存在[40]，在母乳中含量豐富，約占蛋白質(zhì)的2.1%，但其對(duì)嬰兒的生物功能直到近年來才引起關(guān)注。OPN在母乳中質(zhì)量濃度約為138 mg/mL，和牛乳中（18 mg/mL）差異巨大，為配方粉的母乳化提供了新的參考。OPN是一種帶負(fù)電的高磷酸化的糖蛋白，n-鏈糖蛋白介導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)相互作用和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[41]。OPN由一個(gè)拷貝基因編碼，在轉(zhuǎn)錄過程中，OPN可以進(jìn)行選擇性剪接，產(chǎn)生3 個(gè)剪接變體：OPN a（全長(zhǎng)亞型）、OPN b（缺乏外顯子5）、OPN c（缺乏外顯子4）[42]。此外，OPN還可以通過磷酸化、O-糖基化和蛋白水解過程產(chǎn)生多種亞型。OPN亞型具有組織特異性，不同細(xì)胞類型或不同條件下表達(dá)的OPN具有不同的功能[43]。

OPN具有抗病原體感染的生物活性。Taniguchi等發(fā)現(xiàn)OPN敲除乳鼠比野生型乳鼠更容易受到輪狀病毒感染，并在感染后表現(xiàn)出更嚴(yán)重和持久的腹瀉現(xiàn)象[44]。在抑制細(xì)菌感染方面，OPN被證明可以直接與細(xì)菌結(jié)合并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用;通過與細(xì)菌細(xì)胞表面結(jié)合減少牙齒生物膜的形成[45]。這表明，母乳中的OPN還可以通過與入侵的病原體直接相互作用，在免疫防御中發(fā)揮更直接的作用。

OPN在固有層細(xì)胞免疫反應(yīng)中起到重要作用，是調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。OPN可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OPN磷酸化是誘導(dǎo)IL-12表達(dá)的必要條件[46]。因此，母乳OPN可以通過誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)來預(yù)防嬰兒感染。這與母乳喂養(yǎng)嬰兒與配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒在接種麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹疫苗后誘導(dǎo)Th1樣反應(yīng)的觀察差異有關(guān)[47]。此外，牛乳和人乳OPN在嬰兒胃液中37 ℃消化1 h后均能保持活性，表明嬰兒攝入乳源OPN可促進(jìn)嬰兒腸道黏膜表面Th1方向的免疫系統(tǒng)極化[48]。

3.2 乳凝集素

乳凝集素也稱為乳脂球-表皮生長(zhǎng)因子8（MFG epidermal growth factor-8，MFG-E8）或EGF樣重復(fù)序列分泌蛋白，屬于分泌ECM糖蛋白家族。在大多數(shù)物種中，MFG-E8以53 kDa和66 kDa兩種剪接變異形式出現(xiàn)，含有一個(gè)O-糖基化的脯氨酸/蘇氨酸豐富肽鏈[49]。MFG-E8可以被活化的巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、泛肌細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)和釋放，分子質(zhì)量小的MFG-E8主要在部分組織或器官（汗腺、膽管）和體液（血清、尿液、腦脊液）中表達(dá)[50]，分子質(zhì)量大的MFG-E8亞型主要存在于哺乳動(dòng)物的乳脂球膜中，由乳腺上皮細(xì)胞分泌[49]。

MFG-E8在吞噬作用初始化中的作用已在許多研究中得到證實(shí)。Xie Rui等研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8在急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）細(xì)胞吞噬和促凝血及溶解纖維蛋白活性中的作用，MFG-E8預(yù)處理的APL細(xì)胞比單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬作用，同時(shí)凝血酶和纖溶酶顯著降低[51]。吞噬作用在細(xì)胞免疫中具有十分重要的作用，如果吞噬作用不成熟，凋亡細(xì)胞不能被適當(dāng)?shù)厍宄?，將?dǎo)致繼發(fā)性壞死，增加病原體感染概率。MFG-E8調(diào)節(jié)吞噬能力的病理機(jī)制已經(jīng)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中被觀察到，其中MFG-E8水平較高的患者具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)和較高的炎癥生物標(biāo)志物水平;MFG-E8濃度較低時(shí)，吞噬作用呈劑量依賴性增加，但超過最佳水平后，作用向抑制吞噬轉(zhuǎn)移[52]。

此外，MFG-E8在促嬰兒免疫發(fā)育的作用還體現(xiàn)在其促進(jìn)血管組織發(fā)育，增強(qiáng)血液循環(huán)作用。MFG-E8在血管組織（動(dòng)脈、毛細(xì)血管的主動(dòng)脈、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及腫瘤血管周圍）中均有表達(dá)[53]。Hidai等證實(shí)了與MFG-E8的C2結(jié)構(gòu)域具有同源性的蛋白發(fā)育性內(nèi)皮細(xì)胞位點(diǎn)-1（developmental endothelial cell site-1，Del-1）是αVβ3整合素受體的配體，能夠促進(jìn)胚胎血管重構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，MFG-E8可能是血管生成的一種潛在調(diào)控因子[54]。

3.3 細(xì)胞因子

在過去的20 年里，在母乳中發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)胞因子，主要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transformed growth factor-β，TGF-β）、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等。母乳中細(xì)胞因子的主要來源是乳腺上皮細(xì)胞或母乳中的免疫細(xì)胞，此外還有通過乳母體循環(huán)進(jìn)入母乳的細(xì)胞因子。目前對(duì)于新生兒免疫系統(tǒng)和腸道屏障的發(fā)育影響研究廣泛的細(xì)胞因子主要有TGF-β、IL-10、IL-6等，其對(duì)嬰幼兒免疫應(yīng)答的積極影響已經(jīng)得到了普遍認(rèn)可。

體外和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，乳源性細(xì)胞因子在腸上皮細(xì)胞增殖和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，對(duì)于腸道屏障的成熟是必不可少的，如TNF[55]、IL-10[56]和IL-6[57]。此外，TNF和TGF-βl對(duì)IECs具有抗凋亡影響[55,58]。從腸道通透性來說，IL-10具有增強(qiáng)腸道的完整性和緩解IFN-γ的屏障破壞效果，并且IL-10受體1基因缺失型小鼠腸道通透性顯著增加[59]。Kuhn等的一項(xiàng)研究顯示IL-6缺失小鼠腸道上皮屏障蛋白表達(dá)降低，黏液層變薄，提示IL-6在腸道完整性中發(fā)揮作用[60]。

3.4 黏蛋白

MUC在MFGM中含量豐富，是一種分子量較大的糖蛋白，其典型分子質(zhì)量為200～2 000 kDa，母乳中MUC1和MUC4豐度最高。MUC蛋白具有高度糖基化的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，這使得它們對(duì)消化有抵抗力，并有可能成為病原體的誘餌。MUC1和MUC4在胞間和胞外基質(zhì)相互作用、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)特性中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[61]，參與嬰幼兒的腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)。

MUC是成年人消化道大量分泌的一類蛋白，在消化道中不會(huì)被分解利用，但對(duì)于消化道黏膜免疫起到重要作用。嬰幼兒胃腸道屏障發(fā)育不完善，不能自發(fā)產(chǎn)生MUC提供有效的黏膜免疫屏障，因此母乳中MUC是抗消化道感染、調(diào)節(jié)免疫的重要組分。

MUC也具有抗病原體黏附的調(diào)節(jié)功能，其降低幽門螺旋桿菌感染的作用已經(jīng)得到了證實(shí)。幽門螺桿菌菌體產(chǎn)生的BabA和SabA黏附素，與MUC1具有強(qiáng)烈的親和性，能夠結(jié)合并從胃細(xì)胞分離脫落。因此，MUC1通過空間位阻抑制與細(xì)胞表面的黏附來保護(hù)上皮細(xì)胞不受非MUC1結(jié)合細(xì)菌的侵襲，并通過充當(dāng)可釋放的誘餌來防止MUC1結(jié)合細(xì)菌的侵襲[62]。

抑制致病菌的生長(zhǎng)和感染能力是MUC抗消化道感染的另一機(jī)制。在母乳濃度下，MUC1和MUC4能夠抑制兩種靶細(xì)胞類型的沙門氏菌侵襲，并以劑量依賴的方式抑制沙門氏菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲[63]。

MUC能夠通過介導(dǎo)TLRs調(diào)節(jié)嬰幼兒先天免疫，MUC1是TLRs的負(fù)向調(diào)控因子。Ueno等證實(shí)MUC1可能通過抑制TLR5信號(hào)通路起到抗炎作用，在各種病原菌的感染和炎癥過程中發(fā)揮重要作用[19]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，MUC1通過髓樣分化初級(jí)反應(yīng)基因88適配器蛋白介導(dǎo)TLR3炎癥信號(hào)通路的表達(dá)，抑制下游促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，減少細(xì)胞凋亡[20]。

4 microRNA

自1993年被首次發(fā)現(xiàn)以來，microRNA（也稱為miRNA）已經(jīng)被普遍認(rèn)為是人類、動(dòng)物和植物轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子。miRNA是指一類從細(xì)胞、組織和體液中分離到非常小的非編碼RNA（長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸），通過與mRNA靶標(biāo)結(jié)合發(fā)揮作用，能夠抑制mRNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，或促進(jìn)mRNA降解，發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的功能。miRNA調(diào)控哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，其功能包括調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育[64]，釋放炎癥介質(zhì)[65]，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[66]的分化。母乳中含有豐富的miRNA，部分miRNA已經(jīng)被證實(shí)能夠在胃腸道中保持活性并調(diào)節(jié)基因，如在母乳中存在的牛奶miRNA、miR-182和miR-200已經(jīng)被證明能夠在成人胃腸道中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用[67-68]。因此，闡明母乳miRNA在母乳喂養(yǎng)期間對(duì)嬰兒的命運(yùn)和功能，以及在此期間產(chǎn)生的任何長(zhǎng)期影響，將是非常有意義的。

表 1 免疫相關(guān)的miRNA母乳中的表達(dá)和功能Table 1 Expression and functions of immune-related miRNAs in human milk

母乳中的大多數(shù)miRNA的主要功能都是參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，而且這些miRNA的含量尤其豐富，其中部分miRNA在母乳中的分布和功能見表1。miRNA參與了免疫系統(tǒng)的幾種機(jī)制，如調(diào)節(jié)B和T細(xì)胞的分化和發(fā)育，以及先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。此外，miRNA在自身免疫性疾病如炎癥性腸病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)這些疾病的發(fā)生或預(yù)防[69]。miR-17和miR-92家族在母乳中表達(dá)水平較高并具有調(diào)節(jié)單核細(xì)胞發(fā)展以及B和T細(xì)胞的分化和成熟的功能[70]，在生命的早期免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。母乳富含B細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的miRNA，如miR-155等，可能在嬰兒體內(nèi)誘導(dǎo)B細(xì)胞分化[71];另一方面，被認(rèn)為是B細(xì)胞抑制因子的miR-150在母乳中含量低于成人機(jī)體[72]。Zhou Qi等在母乳外泌體中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，在10 個(gè)最豐富的miRNA中，有4 個(gè)與免疫功能相關(guān)，包括miR-148a-3p、miR-30b-5p、miR-182-5p、miR-200a-3p[73]。其中，miR-30b-5p已知可誘導(dǎo)免疫抑制，降低免疫細(xì)胞活化[74]，miR-182-5p可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[75]。

5 結(jié) 語

母乳的成分復(fù)雜且個(gè)體差異很大，同一個(gè)體不同哺乳時(shí)期的母乳成分也不相同，這為母乳成分對(duì)嬰幼兒生理功能研究增加了許多障礙。但母乳成分免疫功能的研究，對(duì)于提高人類哺乳生物學(xué)知識(shí)的了解，深入認(rèn)識(shí)嬰兒腸道屏障和免疫功能成熟，優(yōu)化配方乳粉的生物功能是至關(guān)重要的。目前，HMO、母乳脂質(zhì)、母乳蛋白及miRNA為主的分子降低感染和促進(jìn)腸道屏障功能已有較深入的認(rèn)識(shí)，但其分子機(jī)制尚未闡明，需要進(jìn)一步的研究。