趙孟浩，馮祎濃，尹玉文，李承前，孫國杰,*

（1.河北科技大學生命科學與工程學院，河北 石家莊 050018;2.河北禾盛源生態(tài)農業(yè)科技開發(fā)有限公司，河北 唐山 063000）

生物體在新陳代謝過程中會不斷產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），過量ROS會對DNA、脂質、蛋白質等生物分子產生損傷。炎癥出現(xiàn)的一個重要因素就是ROS的增加[1]。研究表明，炎癥可使主動脈脂質異常積聚，形成粥樣斑塊，導致心腦血管疾病的發(fā)生[2]。內源性抗氧化物質不足以完全防止損傷，因此從外部補充抗氧化劑對于維持機體健康至關重要[3]。丹酚酸B作為丹參水溶性成分中含量最高的功能性物質[4]，體外抗氧化實驗證明丹酚酸B有抗氧化和清除自由基的能力。大量細胞實驗[5-7]也表明，丹酚酸B作為丹參中活性最強的水溶性物質有很強的抗氧化能力[8]。

腸道作為藥物消化吸收的主要場所，在藥物代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。對編碼基因比人類基因組還要多100 倍的腸道微生物來說，不僅在營養(yǎng)物質的消化過程[9]中扮演著重要的角色，在代謝[10]和免疫[11-12]中依然起著重要的作用。大量的研究表明，腸道微生物群落的失調和異常會導致糖尿病[13]、心血管疾病[14]、肝病[15]和肥胖癥[16]等多種疾病。丹酚酸B和腸道微生物都被證實和心血管疾病相關，而對于丹酚酸B和腸道微生物之間關系的研究較少。丹酚酸B屬于多酚物質，多酚物質在腸道中主要的調節(jié)方式有2 種：一種是為微生物提供代謝底物，促進有益菌的繁殖;另一種是利用抗菌活性抑制有害菌的繁殖?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本實驗進行了針對丹酚酸B的體內抗氧化實驗和腸道微生物群落分析，研究丹酚酸B對腸道微生物的影響，為治療心血管疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級昆明小鼠，體質量（20±2）g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（冀）2013-1003。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所;Stool Genomic DNA kit糞便基因組DNA提取試劑盒北京康為世紀生物科技有限公司;蛋白濃度測定試劑盒 北京Solarbio科技有限公司;丹酚酸B為自制品（含量83.8%）;其他溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UPR-11-10T超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16G離心機 上海安亭科學儀器廠;SpectraMax i3酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司;DYY-6C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;Ketagalan GL凝膠成像分析系統(tǒng) 美國威泰克公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及給藥

將30 只SPF級昆明小鼠于日光燈照明下，12 h晝夜交替，溫度（25±1）℃，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。小鼠分成5 組：正常組（NC組，灌胃生理鹽水）、丹酚酸B低劑量組（L組，灌胃30 mg/kgmb丹酚酸B）、丹酚酸B中劑量組（M組，灌胃60 mg/kgmb丹酚酸B）、丹酚酸B高劑量組（H組，灌胃120 mg/kgmb丹酚酸B）、VC陽性對照組（PC組，灌胃100 mg/kgmbVC）。每組6 只，標記后稱量并記錄初始體質量，每日上午9∶00通過灌胃給藥，給藥42 d。

1.3.2 樣品采集

末次給藥24 h后，將所有小鼠分隔開，收集糞便。每組選取4 只小鼠糞便進行基因組的提取。通過眼球采血方式收集血液，3 500 r/min離心10 min取上清液，置于-20 ℃冰箱待用。斷頭脫臼處死小鼠，取小鼠心、肝、腎、脾組織，稱質量用于計算臟器指數(shù)。將肝臟組織用質量分數(shù)0.9%的生理鹽水制備成質量分數(shù)10%的肝勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 小鼠糞便基因組提取和處理

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）;806R（5’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’）。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，HiSeq2500 PE250上機測序[17]。

1.3.4 指標檢測

小鼠體質量的變化量按照式（1）計算。

式中：m1為灌胃不同時間后的體質量/g;m2為最初體質量/g。

小鼠臟器指數(shù)按式（2）計算。

按照試劑盒說明檢測MDA的含量和SOD、GSH的活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

腸道微生物群落利用LEfSe軟件對差異組間進行分析，先對所有組樣品間進行Kruskal-Wallis秩和檢驗（一種多樣本比較時常用的檢驗方法），將篩選出的差異再通過wilcoxon秩和檢驗（一種兩樣本成組比較常用的檢驗方法）進行兩兩組間比較，最后篩選出的差異使用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）展示[18]。默認展示P＜0.05、LDA＞2的菌群。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計學差異。若方差齊，差異采用LSD法進行多重比較，若方差不齊則采用Games-Howell比較。測定結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠糞便細菌基因組的提取

圖 1 小鼠糞便細菌基因組電泳圖Fig. 1 Electropherogram of mouse fecal bacterial genome

圖 2 PCR產物電泳圖Fig. 2 Electropherogram of polymerase chain reaction amplified products

每組選取4 只小鼠糞便進行糞便基因組的提取，提取后電泳圖如圖1所示。從每組4 個基因組中選取3 個進行PCR擴增，擴增條帶大小465 bp，擴增后電泳圖如圖2所示。擴增后產物條帶位置正確，條帶清晰，無雜帶，可以用于后續(xù)實驗。

2.2 小鼠體質量的變化

表 1 小鼠體質量的變化（n＝ 6）Table 1 Changes in body mass of mice (n= 6)g

由表1可知，小鼠在灌胃丹酚酸B 6 周之后，各實驗處理組相對于正常組體質量變化沒有顯著差異。

2.3 小鼠臟器指數(shù)

表 2 小鼠臟器指數(shù)（n＝ 6）Table 2 Mouse organ coefficients (n= 6)

臟器指數(shù)增大表明臟器充血、水腫和增生肥大。臟器指數(shù)減小則是發(fā)生了臟器萎縮和其他退行性變化[19]。由表2可知，在灌胃6 周后，小鼠心臟和脾臟的臟器指數(shù)沒有差異。可是肝臟和腎臟的臟器指數(shù)卻值得關注。肝臟中，中劑量、高劑量和陽性對照組相對于正常組臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。腎臟中，高劑量相對于正常組臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）;陽性對照組相對于正常組極顯著降低（P＜0.01）。對于肝臟和腎臟是否是出現(xiàn)了病變，還需要進一步的組織切片觀察。針對目前得到的結果可知，丹酚酸B水溶性成分的主要靶器官是肝臟和腎臟。這與Li Xiaochuan等[20]在大鼠口服丹酚酸B后，得到丹酚酸B各組織中水平由高到低的順序（腎＞肺＞肝＞心＞脾＞腦）相似。

2.4 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中SOD活力的影響

Wang Yingchun等[21]通過實驗得到，丹酚酸B可以通過保護肝臟線粒體的方式，調節(jié)脂質代謝過程，治療非酒精性脂肪性肝炎。丹酚酸B對CCl4誘導的大鼠肝纖維化也具有一定的抗肝損傷作用，減少肝臟膠原沉積和氧化損傷[22]。所以本實驗只測定肝臟和血清中SOD活力，灌胃6 周丹酚酸B后，只有血清中陽性對照組相對于正常組顯著增加;隨著丹酚酸B劑量增加，肝臟和血清中的SOD活力同樣增加（表3）。組別 肝臟SOD活力/（U/mg） 血清SOD活力/（U/mL）

表 3 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中SOD活力的影響（n＝ 3）Table 3 Effect of salvianolic acid B on SOD activity in liver and serum of mice (n= 3)

2.5 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中MDA水平的影響

組別 肝臟MDA含量/（nmol/mg） 血清MDA濃度/（nmol/mL）

表 4 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中MDA水平的影響（n＝ 3）Table 4 Effect of salvianolic acid B on MDA levels in liver and serum of mice (n= 3)

MDA是脂質過氧化產物，可用作評估氧化應激的指標[23]。由表4可知，在肝臟中，高劑量組相對于正常組MDA有顯著性降低（P＜0.05），在血清中，中劑量組相對于正常組有顯著性降低（P＜0.05），高劑量組和陽性對照組相對于正常組極顯著性降低（P＜0.01）。說明丹酚酸B在中、高劑量時，和VC一樣具有減輕機體受到氧化應激的功能。這與Chen Yonghong[24]和Ma[25]等得到的結果相似，他們指出丹酚酸B可以顯著抑制脂質過氧化，并在缺血再灌注模型中增強SOD活性，提高GSH含量。

2.6 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中GSH含量的影響

表 5 丹酚酸B對小鼠肝臟和血清中GSH含量的影響（n＝ 3）Table 5 Effect of salvianolic acid B on GSH contents in liver and serum of mice (n= 3)

由表5可知，肝臟中GSH含量在各組中沒有顯著性變化，而在血清中、高劑量組GSH濃度顯著增加（P＜0.05），相較于陽性對照組增加更多。

2.7 微生物群落差異分析結果

2.7.1 樣品多樣性指數(shù)分析結果

圖 3 操作分類單元稀釋性曲線Fig. 3 Rarefaction curves of operational taxonomic units

圖 4 Rank abundance曲線Fig. 4 Rank abundance curves

如圖3所示，各樣品的稀釋曲線已經趨于平緩，測序量遠遠大于曲線拐點量，說明本研究樣本測序深度及覆蓋度足夠，其測序深度可以代表大多數(shù)微生物種類。如圖4所示，Rank abundance曲線在水平橫軸上的跨度較大，分類的豐富度較高。在垂直方向上曲線平緩，物種分布均勻。相對豐度高于10-3的菌種在各樣本中都較少，隨著菌群數(shù)量逐漸增加，樣本豐度降低。在菌群豐度至10-5時，曲線接近平臺期。大部分樣品測得的菌屬在400～600之間。

圖 5 Shannon稀釋曲線Fig. 5 Shannon rarefaction curves

如圖5所示，各藥物組均比正常組Shannon指數(shù)大，表示各藥物組樣品菌群豐富度增加，曲線趨于平緩，測序深度增加已經不影響物種多樣性，測序量趨于飽和。

2.7.2 菌群組成分析結果

圖 6 門水平下微生物種類分布圖Fig. 6 Microbial composition at phylum level

如圖6所示，在門分類水平下，給藥組相對于正常組，除Firmicutes（厚壁菌門）上升外，Bacterbidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Actinobacteria（放線菌門），其他菌門相對豐度均下降。

圖 7 種水平下微生物種類分布圖Fig. 7 Microbial composition at species level

如圖7所示，在種水平下給藥組與正常組比較，主要是Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis兩種菌相對豐度增加。給藥組中Bacteroides uniformis菌相對正常組相對豐度降低，降低程度大于陽性對照組。

2.7.3 LEfSe菌群差異分析結果

圖8A展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大?。礊榫€性判別分析值）。隨后通過將差異映射到已知層級結構的分類樹上方式得到進化分支圖（圖8B）。在進化分支圖中，由內至外輻射的圓圈代表了由門至屬（或種）的分類級別。篩選P＜0.05、LDA＞2的菌落進行展示和比較，如圖8A1、B1所示，在灌胃低劑量的丹酚酸B后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus、Bacteroides thetaiotaomicron兩個菌豐度增加明顯。厚壁菌門中LachnospiraceaeFCS020 group、Ruminiclostridium6兩個菌豐度增加明顯。放線菌門中Gordonibacter豐度增加明顯。如圖8A2、B2所示，在灌胃中劑量的丹酚酸B后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門和綠彎菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis兩個菌豐度增加明顯。厚壁菌門中mouse gut metagenome豐度增加明顯。綠彎菌門Chloroflexi豐度也有所增加，可是具體屬種并不知道。如圖8A3、B3所示，在灌胃高劑量的丹酚酸B后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus，Parabacteroides distasonis兩個菌豐度增加明顯。厚壁菌門中mouse gut metagenome、Tyzzerella3、MollicutesRF9豐度增加明顯。放線菌門中Gordonibacter豐度增加明顯。圖8A4、B4所示，在灌胃VC后，腸道中擬桿菌門、厚壁菌門豐度均增加。在更加精確的分類水平下，擬桿菌門中Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis豐度增加明顯。厚壁菌門中Roseburia、MollicutesRF9豐度增加明顯。

圖 8 正常組和丹酚酸B各劑量組菌群差異分析Fig. 8 Analysis of differences between normal group and salvianolic acid B treatment groups

在灌胃低劑量和高劑量丹酚酸B實驗組中，發(fā)現(xiàn)放線菌門中Gordonibacter菌豐度增加明顯。該菌的兩個菌種Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378 T）和Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213 T）具有將鞣花酸代謝為尿石素的功能[26-27]。尿石素A（urolithin A，UA）是由鞣花單寧在腸道菌群中生成的一種天然代謝產物[28]。UA可以抑制髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，MPO是一種在多形核中性粒細胞和巨噬細胞中表達的血紅素蛋白，其含量在炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）[29]和其他炎癥性疾病血漿中顯著增加[28]。

在對比生理鹽水組后，所有的藥劑組中Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis豐度均有增加。根據(jù)Yoshida等[30]的研究可知，灌胃具有活性的B. vulgatus和B. dorei至小鼠體內，減弱動脈粥樣硬化，明顯改善內毒素血癥。通過減少腸道微生物脂多糖的產生，保護小鼠免于動脈粥樣硬化。

Parabacteroides distasonis的豐度增加對改善IBD[31]、多發(fā)性硬化[32]、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[33]和肥胖[34]有益處。通過體內、體外實驗發(fā)現(xiàn)Parabacteroides distasonis具有很強的將原發(fā)性膽汁酸轉化為二級膽汁酸的能力，所以該菌通過誘導膽汁酸代謝的變化改善ob/ob小鼠的脂質代謝過程并能減輕NAFLD程度[35]。Koh等通過實驗發(fā)現(xiàn)Parabacteroides distasonis具有抗炎癥和抗腫瘤的效果，Parabacteroides distasonis通過減弱Toll樣受體4信號傳導和阻斷Akt活化，抑制小鼠結腸腫瘤的形成[36]。

3 結 論

在臟器指數(shù)統(tǒng)計中，肝臟和腎臟的臟器指數(shù)隨劑量增加而下降。小鼠體內抗氧化指標檢測結果顯示，在沒有構建損傷模型的情況下灌胃丹酚酸B，SOD活力只有增加的趨勢，在肝臟和血清中，各劑量組相較于正常組沒有顯著性增加。相較于正常組，GSH活力只在血清高劑量組中具有顯著性增加。相較于肝臟正常組，高劑量組MDA含量顯著性降低;相較于血清正常組，中劑量組MDA含量顯著性降低，高劑量組極顯著性降低。因此，丹酚酸B具有治療心血管疾病的作用。在口服丹酚酸B后，通過菌群差異分析發(fā)現(xiàn)Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis在給藥組中豐度均增加，且差異顯著。Parabacteroides distasonis具有抗炎抗腫瘤的功能，并參與膽汁酸的代謝過程。Bacteroides vulgatus可以抑制體內脂多糖的產生，改善動脈粥樣硬化。

通過以上實驗，可知丹酚酸B具有體內抗氧化活性，同時可以影響腸道菌群的構成，然而是否通過上述已知功能菌群發(fā)揮藥理作用還需要進一步研究。