楊琴琴，胡 江，牛 熙, 2*，黃世會(huì)，冉雪琴，王嘉福, 2，王江嵐，令狐紹進(jìn)，呂 婷，李 騁

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院, 貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025；2.貴州省山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程2011協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】高羊茅(Festucaarundinacea)作為世界重要的草坪草和優(yōu)質(zhì)飼草備受學(xué)者重視，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)屬貴州本地高羊茅品種，是貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所利用貴州野生高羊茅資源培育而成。前期研究發(fā)現(xiàn)，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)高羊茅表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性，且黔草1號(hào)的抗旱性強(qiáng)于黔草2號(hào)[1]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在高羊茅抗逆性的研究方面取得較大進(jìn)展，但主要針對(duì)其在干旱等逆境脅迫的生理變化，以及內(nèi)生真菌和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等對(duì)高羊茅抗性的影響等，在其抗逆基因的分離克隆、表達(dá)調(diào)控等分子機(jī)理研究方面極少報(bào)道。因此，開展高羊茅抗旱基因研究對(duì)其抗旱機(jī)理研究具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(late embriogenesis abundant protein，LEA)是植物抗旱性相關(guān)蛋白，在植物種子胚胎發(fā)育后期大量積累，當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，這類蛋白因具有高親水性，在面臨干旱脅迫時(shí)能夠捕獲足夠的水分以保護(hù)細(xì)胞不受傷害[2-5]。根據(jù)氨基酸序列同源性及保守結(jié)構(gòu)域基元，LEA蛋白可分為6組[6-7]，其中，第3組LEA(LEA3)的結(jié)構(gòu)特征最為明顯，序列保守性強(qiáng)，具有一段串聯(lián)重復(fù)排列，該序列含有多個(gè)的基元序列，每個(gè)基元序列包含11個(gè)氨基酸(T/AA/TO/EA/TA/TK/RQ/EDK/RA/TXE/DQ)[8]。該基元序列可形成親水的α-螺旋結(jié)構(gòu)，在植物受到干旱脅迫時(shí)能防止組織過度失水，同時(shí)避免細(xì)胞內(nèi)高濃度離子積累引起的細(xì)胞損傷[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已有報(bào)道在多種植物中克隆得到LEA3基因[11-19]，但對(duì)于黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與植物抗旱性的關(guān)系不甚明了。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用RT-PCR克隆獲得黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索其進(jìn)化保守性及在苗期干旱脅迫下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討高羊茅LEA3基因結(jié)構(gòu)及其抗旱性之間的關(guān)系提供依據(jù)，也為高羊茅抗旱機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

高羊茅品種黔草1號(hào)(代碼QC1)和黔草2號(hào)(代碼QC2)，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所提供。試驗(yàn)菌株為大腸桿菌(EscherichacoliDH5α)，貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院動(dòng)物分室儲(chǔ)藏并提供。主要試劑，pMD19-T Vector試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；植物基因組RNA提取試劑盒、2×Taq PCR Mastermix試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和普通小型質(zhì)粒DNA提取試劑盒均購自天根生物科技北京有限公司。引物和核苷酸序列測(cè)定由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 高羊茅品種LEA3基因克隆 試驗(yàn)于2019年3月在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院動(dòng)物分子與基因工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，分別剪取1 g生長(zhǎng)2年的黔草1號(hào)和黔草2號(hào)葉片凍存于-80 ℃冰箱，用于RNA的提取及LEA3基因的克隆。

1.2.2 高羊茅品種苗期干旱脅迫LEA3基因表達(dá) 試驗(yàn)于2019年3月在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院動(dòng)物分子與基因工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用牛熙等[1]的方法，對(duì)黔草1號(hào)和黔草2號(hào)種子進(jìn)行消毒，于室溫下播種于塑料花盆內(nèi)(口徑為25 cm，高25 cm)。在25 ℃環(huán)境下萌發(fā)3 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，置于Hogland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行液體培育8 d，之后將幼苗分別移入-1.5 MPa、-2.5 MPa 2種不同水勢(shì)的聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000，PEG 6000)溶液(用Hogland營(yíng)養(yǎng)液配制)進(jìn)行根際干旱脅迫處理(PEG脅迫)，分別采集脅迫后0、1、2、3和4 d的葉片組織1 g，液氨速凍，并保存在-80 ℃冰箱。3株混樣作1次生物學(xué)重復(fù)，共3次重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1LEA3基因的克隆 ①總RNA提取與cDNA的合成。取1 g葉片置于液氮中研磨至粉狀，用酸酚-異硫氰酸胍-氯仿法提取葉片總RNA[20]。用1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取葉片總RNA的質(zhì)量。以總RNA為模板，按照ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作步驟合成cDNA。②LEA3基因的克隆。參照已登錄大麥(Hordeumvulgare，F(xiàn)J026802.1)LEA3基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，引物序列見表1。引物P1和P2組合，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度382 bp，得到LEA3基因的上半段；引物P3和P4組合，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度406 bp，得到LEA3基因的下半段。PCR反應(yīng)體系20 μl：2×TaqPCR Master Mix 10 μl，上、下游引物各0.2 μl(10 μmol/L)，cDNA 1 μl(100 ng/μl)，ddH2O 8.6 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。目的片段經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并經(jīng)膠回收試劑盒回收，與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，將構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布含0.1 %的LB瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選單菌落，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定，各選取3個(gè)陽性克隆子測(cè)定核苷酸序列。

1.3.2LEA3基因序列分析 應(yīng)用DNAStar程序進(jìn)行序列分析。通過NCBI的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)序列相似性檢驗(yàn)，利用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)在線分析蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成，利用protscale(http://cn.expasy.org/tools/protscale.html)分析親水性/疏水性。利用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。在線軟件SOPMA(http://npsa.pbil.ibcp.fr/)預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，以MEGA 7.0軟件Neighbor-Joining法分析系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析所用序列的來源分別為黔草1號(hào)和黔草2號(hào)葉片基因完整編碼區(qū)CDS序列，由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院動(dòng)物分子與基因工程實(shí)驗(yàn)室克隆獲得并登錄到NCBI數(shù)據(jù)庫，小麥、大麥以及水稻等11個(gè)物種LEA3氨基酸序列均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(表2)。

1.3.3 基因表達(dá)分析 以不同干旱脅迫時(shí)間(0、1、2、3和4 d)葉片RNA為模板，進(jìn)行不同品種高羊茅苗期持續(xù)干旱脅迫下基因的表達(dá)分析。按照ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作步驟合成cDNA。以qLEAU和qLEAD為引物，利用RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)(ABI 7500PCR儀)，3次重復(fù)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以qGADPHU和qGADPHD為引物擴(kuò)增GADPH基因作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)包含3次技術(shù)重復(fù)。基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)值采用Mean±Standard deviation 表示，經(jīng)Students’ t-test 檢驗(yàn)在P<0.05 水平時(shí)認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個(gè)高羊茅品種LEA3基因克隆與測(cè)序

2.1.1LEA3基因序列 通過總RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因上半段擴(kuò)增均獲得360 bp左右大小的片段，LEA3基因下半段擴(kuò)增均獲得400 bp左右大小的DNA片段。與預(yù)期片段大小相近，條帶清晰(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，黔草1號(hào)LEA3基因上半段為361 bp，下半段為377 bp；黔草2號(hào)LEA3基因上半段為394 bp，下半段為410 bp。去除重疊部分，拼接后黔草1號(hào)獲得609 bp片段，黔草2號(hào)獲得642 bp。與已知序列相比，2個(gè)品種的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的大麥(AKC92683.1)的LEA3基因序列相似性最高，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)分別為87.60 %和85.4 %，2個(gè)樣品的擴(kuò)增序列為L(zhǎng)EA3基因。其中，黔草1號(hào)LEA3基因完整的ORF框長(zhǎng)度為609 bp，共編碼202個(gè)氨基酸；黔草2號(hào)LEA3基因完整的ORF框長(zhǎng)度為642 bp，共編碼213個(gè)氨基酸。

表1 引物序列

表2 LEA3序列登錄號(hào)

M為DL2000 DNA Marker；泳道1、2分別為黔草1號(hào)及黔草2號(hào) LEA3基因上半段；泳道3、4分別為黔草1號(hào)及黔草2號(hào) LEA3基因下半段

2.1.2LEA3基因序列比對(duì) 將黔草1號(hào)、黔草2號(hào)LEA3基因編碼氨基酸序列與擬南芥等植物的相應(yīng)序列比較發(fā)現(xiàn)，黔草1號(hào)、黔草2號(hào)LEA3基因編碼氨基酸序列均存在多個(gè)11個(gè)氨基酸組成的基元序列(TAQAAKEKAGE)，符合第三組LEA蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征[21-22]。其中，黔草2號(hào)LEA3基因編碼氨基酸序列共包含8個(gè)基元序列；黔草1號(hào)包含7個(gè)基元序列(圖2)，較黔草2號(hào)缺失1個(gè)基元序列(11個(gè)氨基酸)。另外，從黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因編碼的氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)12個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生改變。

2.2 2個(gè)高羊茅品種LEA3蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)

2.2.1 LEA3蛋白的氨基酸組成 從表3看出，黔草1號(hào)和黔草2號(hào) LEA3蛋白均含丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等親水性氨基酸，且不含半胱氨酸、脯氨酸和色氨酸，與INGRAM等[21]研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸僅在黔草2號(hào)中存在，而苯丙氨酸僅在黔草1號(hào)中存在。

2.2.2 LEA3蛋白的理化性質(zhì) 黔草1號(hào)LEA3基因編碼蛋白的分子量為20.72 kDa，等電點(diǎn)8.55，總平均親水性為-0.971；黔草2號(hào)LEA3基因編碼蛋白分子量為22.01 kDa，等電點(diǎn)8.99，總平均親水性為-1.069(圖3)。2個(gè)品種 LEA3蛋白均有很強(qiáng)的親水性，且呈一定周期性，形成多個(gè)親水性高峰?？傮w看，黔草2號(hào) LEA3蛋白親水性大于黔草1號(hào)。2個(gè)品種LEA3蛋白均不包含跨膜區(qū)域，屬于非跨膜蛋白。黔草1號(hào) LEA3由73.76 % α-螺旋、19.31 %無規(guī)卷曲、3.96 %延伸鏈和2.97 % β-折疊構(gòu)成；黔草2號(hào) LEA3由77.46 % α-螺旋、14.55 %無規(guī)卷曲、4.23 %延伸鏈和3.76 % β-折疊構(gòu)成(圖4)。

下劃線代表11個(gè)氨基酸的基元序列，---代表黔草1號(hào)缺失11個(gè)氨基酸的基元序列，方框代表突變的氨基酸，*表示終止密碼子

表3 黔草1號(hào)和黔草2號(hào) LEA3蛋白氨基酸組成及其含量

圖3 黔草1號(hào)和黔草2號(hào) LEA3 蛋白的親水性/疏水性分析

長(zhǎng)豎線為α-螺旋結(jié)構(gòu)，短豎線為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)

2.3 2個(gè)高羊茅品種LEA3基因序列的同源性及進(jìn)化樹

2.3.1 同源性比較 13個(gè)物種的LEA3氨基酸序列多重序列比較(圖5)發(fā)現(xiàn)，黔草1號(hào)和黔草2號(hào) LEA3相似度達(dá)93.6 %，兩者與大麥HvLEA(相似度87.60 %、85.40 %)、山羊草AtLEA3(相似度86.5 %、86.7 %)、冰草AcLEA3-1(相似度84.7 %、84.6 %)和小麥TaLEA3(相似度81.70 %、81.70 %)的相似度最高，其次是水稻OsLEA3(相似度59.9 %、58.9 %)、貴州懸竹AcLEA3(相似度均為64.80 %)，而與小米SiLEA3(相似度56.40 %、54.90 %)和玉米ZmLEA3(相似度52.8 %、52.80 %)同源性較低。

2.3.2 進(jìn)化樹 以擬南芥LEA3氨基酸(AtLEA3-2)序列為外群，將黔草1號(hào)、黔草2號(hào)與其他10個(gè)物種的LEA3氨基酸序列進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。黔草1號(hào)和黔草2號(hào)的LEA3蛋白與小麥、旱麥草、大麥、山羊草、無芒雀麥、冰草聚為一類；貴州懸竹、玉米、小米聚為一類；水稻單獨(dú)為一類，說明黔草1號(hào)和黔草2號(hào) LEA3蛋白與小麥的遺傳距離最近。

2.4 2個(gè)高羊茅品種LEA3基因苗期干旱脅迫的表達(dá)

以管家基因GADPH作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt計(jì)算不同干旱處理下黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因相對(duì)表達(dá)量(表4)。經(jīng)干旱脅迫處理后，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因表達(dá)量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì)。-2.5 MPa PEG 6000處理黔草1號(hào)LEA3基因的表達(dá)量在第2天達(dá)最高峰，為0 d的80倍左右(P<0.01)；黔草2號(hào)LEA3基因表達(dá)量在脅迫處理第1天達(dá)最高峰，為0 d的26倍左右(P<0.01)。-1.5 MPa PEG 6000處理下，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3表達(dá)趨勢(shì)與-2.5 MPa PEG 6000處理的相同，黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因分別在脅迫處理第2天和第1天表達(dá)量達(dá)最高峰，分別為0 d的60和20倍左右(P<0.01)。黔草1號(hào)LEA3基因的表達(dá)量在整個(gè)脅迫過程中總體高于黔草2號(hào)，且2個(gè)品種高羊茅在-2.5 MPa PEG 6000下的LEA3基因的表達(dá)量較-1.5 MPa PEG 6000脅迫高。

圖5 LEA3氨基酸同源性比較

圖6 LEA3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

LEA蛋白是一類與逆境相關(guān)的蛋白質(zhì)，目前LEA2基因(脫水素基因，Dhn)與LEA3基因是研究最多的2類抗旱基因。已有研究證實(shí)LEA3蛋白的積累程度與植物抗旱性呈正相關(guān)[23]。LEA3主要存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且LEA3對(duì)植物組織的脫水性保護(hù)在于其多拷貝基元重復(fù)序列(即11個(gè)氨基酸形成的基元序列)形成的具有高度親水性的兼性α-螺旋結(jié)構(gòu)。雖然目前尚無研究表明基元序列的拷貝數(shù)與抗旱性強(qiáng)弱之間存在關(guān)系[24-25]，但在對(duì)不同品種的青稞品系與LEA3蛋白保守基元拷貝數(shù)之間進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一作物品種中LEA3蛋白基因也具有多態(tài)現(xiàn)象，表現(xiàn)在抗旱性強(qiáng)的品種冬青8號(hào)的LEA3蛋白缺失第4個(gè)保守基元序列，但同時(shí)除LEA3蛋白的保守基元序列拷貝數(shù)存在差異外，編碼框內(nèi)還存在6個(gè)氨基酸親水性的改變[26]。研究對(duì)比黔草1號(hào)和黔草2號(hào)高羊茅品種的LEA3基因編碼氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，黔草1號(hào)、黔草2號(hào)LEA3基因編碼氨基酸序列也存在LEA3蛋白基因多態(tài)現(xiàn)象，即黔草1號(hào) LEA3蛋白比黔草2號(hào)缺失1個(gè)基元序列，且在黔草1號(hào)、黔草2號(hào)LEA3基因編碼的氨基酸序列存在12個(gè)位點(diǎn)的氨基酸差異，這些差異使LEA3蛋白的親水性發(fā)生變化，表現(xiàn)為L(zhǎng)EA3蛋白親水性黔草2號(hào)高于黔草1號(hào)，但LEA3蛋白保守序列基元拷貝數(shù)差異與植物抗旱性強(qiáng)弱之間的關(guān)系，還需要進(jìn)一步研究。

表4 不同干旱處理黔草1號(hào)和黔草2號(hào) LEA3基因的表達(dá)量

4 結(jié) 論

通過克隆測(cè)序獲得高羊茅品種黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因完整的ORF框，長(zhǎng)度分別為609 bp和642 bp，分別編碼203個(gè)氨基酸和213個(gè)氨基酸。比較2個(gè)高羊茅品種LEA3蛋白發(fā)現(xiàn)，黔草1號(hào) LEA3蛋白比黔草2號(hào)缺失1個(gè)包含11個(gè)氨基酸的基元序列，且兩者的氨基酸序列存在12個(gè)位點(diǎn)差異，而這些差異使得2個(gè)高羊茅品種LEA3蛋白在分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親水性上存在差異，黔草2號(hào) LEA3的親水性強(qiáng)于黔草1號(hào)。對(duì)不同干旱處理黔草1號(hào)和黔草2號(hào)LEA3基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，高羊茅品種的抗旱性與其LEA3基因的表達(dá)量呈正相關(guān)，2個(gè)高羊茅品種LEA3基因表達(dá)量均隨干旱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)，黔草1號(hào)LEA3基因表達(dá)量在整個(gè)脅迫過程中總體高于黔草2號(hào)，由此推測(cè)，在受到干旱脅迫時(shí)，黔草1號(hào)更能適應(yīng)干旱環(huán)境。