孫合園,董莉娜,朱麗萌,王文艷

(煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

精神分裂癥是一種慢性的、衰弱性疾病并具有致殘性、終生性,是導(dǎo)致殘疾和死亡的重要原因之一,臨床主要表現(xiàn)為陰性、陽性癥狀和認(rèn)知障礙等[1-3]．該疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,多認(rèn)為其由遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)和其他因素等綜合所致[4-5]．目前主要以抗精神分裂癥藥物治療作為主要的臨床治療方法,其中治療方式又包括單一藥物療法(AMP)和聯(lián)合藥物療法(APP,同時(shí)使用至少2種或2種以上的藥物治療)[6]．

利培酮、阿立哌唑作為抗精神分裂癥臨床一線用藥,常采用聯(lián)合用藥方式．國內(nèi)許多學(xué)者均報(bào)道利培酮與阿立哌唑聯(lián)用后,相比于利培酮單用治療時(shí)療效會(huì)更好[7-8]．相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道利培酮、阿立哌唑可經(jīng)CYP2D6或CYP3A4代謝且均為P-gp的底物[9-11],因此當(dāng)聯(lián)合用藥時(shí)可能會(huì)引起藥物-藥物相互作用(DDI)．本研究采用本實(shí)驗(yàn)室已開發(fā)建立并經(jīng)過驗(yàn)證的LC-MS/MS法[12]對(duì)單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組的大鼠血漿中利培酮、阿立哌及其代謝產(chǎn)物9-羥基利培酮、脫氫阿立哌唑的濃度進(jìn)行測(cè)定,并從藥代動(dòng)力學(xué)的角度探討利培酮、阿立哌唑在大鼠體內(nèi)聯(lián)合用藥時(shí)是否會(huì)發(fā)生DDI．

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

利培酮(99.9%) 和阿立哌唑(>98%) 購自中國藥品生物制品檢定所(北京);阿立哌唑(99.8%) 購自永諾制藥公司 (宜昌);脫氫阿立哌唑(≥98%)購自呈貢生物制品公司 (昆明);脫氫阿立哌唑-d8(98.8%) 購自多倫多研究化學(xué)品公司(多倫多,加拿大)．利培酮-d4(>98%)、9-羥基利培酮(>98%)、9-羥基利培酮-d4(>98%) 購自美國sigma公司,阿立哌唑口崩片購自成都大西南藥業(yè)有限公司,利培酮片購自西安楊森制藥有限公司;色譜純的甲醇、乙腈、異丙醇購自Merck公司(德國);其余所用試劑為分析純．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TSQ Quantum Access 型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo 公司),配備有ESI 離子源和Lcquan數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Aglient 1100 系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),配有四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱;HSC-24A 氮吹儀(天津恒奧科技有限公司);XS-105 生物分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)．

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠(180～220 g)從綠葉制藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得(動(dòng)物合格證號(hào):37009200018723),并置于溫度20±1 ℃,相對(duì)濕度(50±5)%和12 h的受控環(huán)境中明/暗循環(huán)．所有動(dòng)物都嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南(NIH出版物編號(hào)80-23)自由獲取飼料和水．動(dòng)物相關(guān)的所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)煙臺(tái)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

15只SD雄性大鼠禁食不禁水12 h后隨機(jī)分成3組,I組為利培酮單獨(dú)給藥組(1 mg/kg),II組為利培酮與阿立哌唑聯(lián)合給藥組(1 mg/kg+10 mg/kg),III組為阿立哌唑單獨(dú)給藥組(10 mg/kg)．每天灌胃給藥1次,連續(xù)給藥6 d,并在第6天給藥后0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、8 h、12 h、24 h,每時(shí)間點(diǎn)經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈叢采血約0.3 mL至肝素管中,立即離心得血漿樣品,置于-20 ℃冰箱保存．血漿樣品按“2.4”中方法處理后測(cè)定分析利培酮、9-羥基利培酮、阿立哌唑和脫氫阿立哌唑的濃度．

2.2 色譜質(zhì)譜條件:

色譜條件:色譜柱為Agilent XDB-C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm);流速:0.25 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;流動(dòng)相:70%乙腈-30%水,0.01%冰乙酸,0.2 mmol/L醋酸銨．

質(zhì)譜條件:電噴霧離子化電離源(ESI),噴霧電壓為4 000 V;毛細(xì)管溫度為350 ℃;鞘氣和輔助氣壓力分別為30和5 psi;碰撞氣壓力為1.5 minni-Torr．分析物檢測(cè)離子對(duì):RIS為411.1→191.0,9-OH-RIS為427.1→207.0,RIS-d4為415.1→195.0,9-OH-RIS-d4為431.1→211.0,ARI為448.2→284.9,DE-ARI為446.2→284.9,DE-ARI-d8為454.2→293.0,RIS、9-OH-RIS、RIS-d4、9-OH-RIS-d4、ARI誘導(dǎo)解離電壓均為28 eV;DE-ARI、DE-ARI-d8誘導(dǎo)解離電壓均為20 eV．

2.3 溶液配制

儲(chǔ)備液的配制:分別精密稱取阿立哌唑、脫氫阿立哌唑、利培酮、9-羥基利培酮5 mg,用甲醇稀釋至5 mg/mL,作為儲(chǔ)備液．利培酮-d4、9-羥基利培酮-d4、脫氫阿立哌唑-d8為100 μg/mL 的甲醇溶液．取每種分析物的儲(chǔ)備液適量混合,用甲醇連續(xù)稀釋以制備所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控工作液．所有儲(chǔ)備液和工作溶液均置于4 ℃冰箱中備用．

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥溶液的配制:分別將利培酮片、阿立哌唑口崩片研磨成粉末,并根據(jù)藥品標(biāo)示含量進(jìn)行換算稱取適量,分別配制成一定濃度的給藥液．其中利培酮片采用含有0.1%冰乙酸的生理鹽水(pH值為5～6)配制,阿立哌唑片采用生理鹽水配制．

2.4 樣品前處理

采用本實(shí)驗(yàn)室已建立并驗(yàn)證的LC-MS/MS法[12]測(cè)定大鼠血漿中2種非典型抗精神分裂藥物及2種代謝物的濃度,精密移取50 μL大鼠血漿樣品于具塞玻璃管中,加入內(nèi)標(biāo)工作液5 μL和0.1 μmol/L的NaOH溶液25 μL,渦旋混勻30 s,加入3 mL混合提取液(異丙醇∶二氯甲烷∶正己烷=0.1∶1∶2,V/V/V),渦旋提取3 min后,以3 600 r/min離心10 min,將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一干凈玻璃管中,在35 ℃氮?dú)饬鞔蹈?殘余物加入200 μL流動(dòng)相復(fù)溶,13 000 r/min離心10 min后取5 μL進(jìn)樣分析．

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法分別測(cè)定經(jīng)灌胃給予利培酮、阿立哌唑以及利培酮與阿立哌唑后,大鼠血漿中阿立哌唑、脫氫阿立哌唑、利培酮、9-羥基利培酮的血藥濃度．利培酮、9-羥基利培酮、阿立哌唑、脫氫阿立哌唑在0.5～50 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性,相關(guān)系數(shù)>0.987 2,隨行質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度均在±14.69%以內(nèi),精密度均小于14.78%,本測(cè)定方法專屬性良好,準(zhǔn)確度和精密度均符合相關(guān)要求．其血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1、圖2,主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1、表2．

表1 大鼠血漿中利培酮、9-羥基利培酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of risperidone and 9-hydroxyrisperidone in rat plasma

*表示P<0.05.

表2 大鼠血漿中阿立哌唑、脫氫阿立哌唑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of aripiprazole and dehydroaripiprazole in rat plasma

如表1所示,單獨(dú)給予利培酮時(shí),利培酮和9-羥基利培酮Cmax分別為18.48±5.86 ng/mL、35.93±11.80 ng/mL,AUC0-t分別為45.36±9.59 h·ng/mL、120.74±32.53 h·ng/mL;利培酮與阿立哌唑聯(lián)合用藥時(shí),利培酮和9-羥基利培酮Cmax分別為28.67±6.69 ng/mL、48.43±9.80 ng/mL,AUC0-t分別為77.05±23.51 h·ng/mL、210.73±33.25 h·ng/mL．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:利培酮與阿立哌唑聯(lián)用時(shí)利培酮的暴露量為單獨(dú)用藥組的1.70倍,9-羥基利培酮為1.75倍(P<0.05)．如表2所示,單獨(dú)給予阿立哌唑時(shí),阿立哌唑和脫氫阿立哌唑Cmax分別為24.18±5.74 ng/mL、7.28±1.02 ng/mL,AUC0-t分別為202.48±50.02 h·ng/mL、85.91±21.96 h·ng/mL;利培酮與阿立哌唑聯(lián)合用藥時(shí),阿立哌唑和脫氫阿立哌唑Cmax分別為31.80±12.96 ng/mL、6.53±0.51 ng/mL,AUC0-t分別為177.44±39.96 h·ng/mL、67.30±10.88 h·ng/mL．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:利培酮與阿立哌唑聯(lián)用時(shí)阿立哌唑的暴露量為單獨(dú)用藥組的0.88倍,脫氫阿立哌唑?yàn)?.79倍,通過t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,即利培酮對(duì)阿立哌唑沒有顯著影響．

本實(shí)驗(yàn)所采用的劑量主要依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定,由于利培酮與阿立哌唑均由CYP2D6和CYP3A4代謝且同為P-gp的底物,推測(cè)在代謝方面阿立哌唑與利培酮可能對(duì)CYP2D6或CYP3A4產(chǎn)生了競爭性抑制,或在吸收方面兩者對(duì)P-gp產(chǎn)生競爭,從而導(dǎo)致利培酮與9-羥基利培酮在體內(nèi)的暴露量升高,阿立哌唑與脫氫阿立哌唑在體內(nèi)的暴露量產(chǎn)生下降的趨勢(shì),其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步進(jìn)行考察．

4 結(jié) 論

當(dāng)利培酮與阿立哌唑聯(lián)合給藥時(shí)會(huì)引起利培酮在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為的改變,導(dǎo)致體內(nèi)暴露量的增加,提示實(shí)際臨床中兩者合并用藥時(shí)也可能會(huì)發(fā)生類似的藥物-藥物相互作用,有必要進(jìn)一步關(guān)注和研究,以避免臨床上利培酮與阿立哌唑聯(lián)合用藥超過警戒濃度,產(chǎn)生毒副反應(yīng)．