王彥淇 郭玉蓉 王永濤 趙 靚 吳曉蒙* 廖小軍

（1 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 國家果蔬加工工程技術研究中心農業(yè)部果蔬加工重點實驗室 食品非熱加工北京市重點實驗室 北京100083 2 陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院 西安710119）

蘋果是全球消費量最高的水果之一[1]，而我國擁有世界上最大的蘋果及蘋果汁生產量和出口量。目前市場上果汁飲料多是濃縮還原（From Concentrate，F(xiàn)C）果汁，它是在濃縮果汁中還原天然果汁中等量的水后得到的制品[2]，其營養(yǎng)價值低，產品附加值不高。近年來蘋果汁產業(yè)中興起的非濃縮還原（Not From Concentrate，NFC）果汁，是由新鮮原果壓榨后直接殺菌罐裝而成，其未經濃縮及復原工序，具有口感真實且營養(yǎng)成分（特別是抗氧化物質酚類等）保留充分等特點。尼爾森《2018年中國消費市場的十大特點和趨勢》顯示，消費者對于產品的功能性有了更高的追求。中國銀河證券研究部資料顯示，我國NFC 果汁的市場規(guī)模將呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，預計2020年NFC 果汁銷售額將達120 億元。《2015-2022年中國果汁飲料行業(yè)全景調研及投資戰(zhàn)略咨詢報告》顯示，美國NFC 果汁消費量占100%果汁消費結構的60%，已成為市場主流飲品且每年保持著較快的增長。NFC 果汁作為新興健康果汁，迎合了當今消費者“健康、天然、美味”的消費追求，迅速占據了果汁市場。

蘋果多酚的抗氧化和自由基清除能力很高[3-4]，具有促進致癌物代謝，影響癌細胞凋亡的作用[1]，這是其能抑制心血管疾病和前列腺癌、肝癌等癌癥[5]的主要原因。前人[7-9]研究表明蘋果的抗氧化能力更多地來源于多酚組分而非維生素C[6]，抗氧化能力與總酚含量之間存在極大相關性。而蘋果多酚中僅有少數(shù)酚類，如黃酮類化合物[10]的抗氧化能力受到關注，黃酮類化合物在蘋果中含量較低且對總抗氧化能力的貢獻率未知，而其它化合物如原花青素顯示出更強的抗氧化活性[11-13]。這表明蘋果的抗氧化能力不僅與總酚含量有關，還與單體酚組成密切相關。具體酚類或單體酚對總抗氧化能力的作用還需進一步研究。

本文旨在通過超高效液相色譜法和兩種體外抗氧化試驗（DPPH 和ABTS 自由基清除試驗）評價15 種NFC 蘋果汁的單體酚組成和抗氧化能力。通過相關性分析綜合分析多酚含量及單體酚組成的抗氧化性，旨在對蘋果汁企業(yè)原料果品種的選擇提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 種蘋果（“新紅星”、“玉華早富”、“元帥”、“涼香”、“新世界”、“秦艷”、“紅玉”、“喬納金”、“秋香”、“恩派”、“桔蘋”、“自由”、“富士”、“粉紅女士”和“秦冠”），采自西北農林科技大學白水實驗站（中國，陜西），所有品種均于各自商業(yè)采收期采摘。

多酚標準品（沒食子酸、原兒茶酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、綠原酸、4-羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、表兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸、槲皮苷和根皮苷），Sigma-Aldrich（中國）有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、二銨鹽（2，2'-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt，ABTS）、抗壞血酸（食品級），西安晶博生物科技有限公司；甲醇、乙腈、三氟乙酸（色譜級），西安永屹生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)，美國Thermo Electron 公司；syncronis C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國Thermo Electron 公司；UV1800 紫外-可見分光光度計，上海尤尼克有限公司；HU-780 榨汁機，韓國Huron 公司。

1.3 方法

1.3.1 NFC 蘋果汁的制備 工藝流程：蘋果→清洗、去皮去核→護色（0.6%抗壞血酸溶液，30 s）→榨汁、過濾→熱殺菌（98 ℃，30 s）→均質（300 bar）→二次熱殺菌（98 ℃，50 s）→灌裝→冷卻→儲存（4 ℃）。

1.3.2 多酚成分的測定 采用UPLC 法[14]。色譜柱：ThermoRsyncronis C18 色譜柱；柱溫：30 ℃。兩相溶劑系統(tǒng)：溶劑A：30%乙腈和70%甲醇；溶劑B：1‰三氟乙酸和5%甲醇；洗脫梯度見表1，共41 min。進樣量：4.0 μL；檢測波長：280 nm。

表1 流動相洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3.3 抗氧化能力的測定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除率測定[11]將100 μL蘋果汁濾液（以蒸餾水為參比）與0.9 mL 1.5×10-4mol/L DPPH 溶液混合，于18 ℃暗處反應30 min，517 nm 處測定混合物的吸光度。計算公式如下：

式中：A對照——對照組的吸光度；A樣品——蘋果汁濾液的吸光度。

1.3.3.2 ABTS 自由基清除率測定[11]將7 mmol/L ABTS 溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合后，于23 ℃暗處反應16 h 得到ABTS 自由基正離子（ABTS·+）?；旌衔镫S即用80%乙醇溶液稀釋，于734 nm 處測定其吸光度為0.700 ± 0.005。將0.1 mL 待測蘋果汁（以蒸餾水為參比）樣品加入3.9 mL ABTS·+溶液中劇烈震蕩，室溫下暗處反應6 min 后于734 nm 處測定其吸光度。計算公式如下：

式中：A對照——對照組的吸光度；A樣品——蘋果汁濾液的吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

本文中所有試驗平行測定3 組，結果為平均值±標準差。使用origin 8.0 軟件和R 語言3.2.5軟件制圖，SPSS 13.0 軟件處理數(shù)據。單因素方差分析（ANOVA）采用Duncan 法，選取95%置信區(qū)間。

2 結果與分析

2.1 15 種NFC 蘋果汁中單體酚的定性和定量分析

使用UPLC 對蘋果汁的單體酚進行分析。圖1為16 種單體酚標品的混合標樣液相圖。選取幾種NFC 蘋果汁多酚的典型圖譜于圖2中顯示。

結果表明，不同種類的蘋果汁中單體酚組分相似，含量差異顯著。不同單體酚標品中，沒食子酸極性最強，最先出峰；根皮苷極性最弱，最后出峰[15]。標準品中的16 種單體酚中僅槲皮素在15 種蘋果汁中均未檢出。具體每種果汁的單體酚組成見表2。按出峰順序將16 種單體酚在15 種NFC 果汁中的含量表示成熱圖，見圖3。

圖1 16 種單體酚標準品的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of the 16 individual phenolic standards

圖2 秋香（a）、自由（b）、富士（c）、元帥（d）NFC 蘋果汁的UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of the NFC apple juices from Qiuxiang（a），Ziyou（b），F(xiàn)uji（c）and Delicious（d）

UPLC 結果表明，除個別單體酚在某些品種中未檢出外，大部分品種均含有15 種單體酚。為排除不同生長地區(qū)、氣候、生長周期、成熟度、加工方式等因素對不同蘋果中單體酚含量差異的影響[16]，本研究采用同一產地、成熟度一致的蘋果樣品，相同加工方法制汁，控制品種差異為單一變量。

被測果汁中，含量最高的單體酚是綠原酸，這與前人[17-18]研究結果一致，其次分別是原花青素B2、表兒茶素和表沒食子兒茶素，它們在15 種果汁中均有檢出，含量最低的是表兒茶素沒食子酸酯和咖啡酸。

圖4顯示15 種NFC 蘋果汁中總酚指數(shù)（Total Phenols Index，TPI）和三大類多酚的含量?？偡又笖?shù)是指用UPLC 方法測定的所有單體酚含量的總和[5]。在15 種蘋果中總酚指數(shù)差異明顯，其中，“秋香”的總酚指數(shù)最高（400 μg/mL），“自由”和“秦冠”次之，“恩派”最低（173.8 μg/mL），這與Tsao 等[19]對10 種白肉蘋果中多酚含量的研究結果相似。

本研究中，15 種NFC 蘋果汁中多酚主要有3類：原花青素、酚酸和黃酮類。Fabio 等[8]在“元帥”蘋果果肉中檢出原花青素等主要多酚的結果也佐證了本試驗結果的可靠性。蘋果汁中主要的原花青素類物質包括表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯，主要的酚酸類物質為沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸和鞣花酸，黃酮類物質主要有蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷和根皮苷。原花青素和酚酸作為蘋果汁中兩類最主要的多酚類物質[20]，在本研究中分別占總酚含量的32.4%和64.0%，它們對蘋果汁的抗氧化性起著重要作用。鮮食蘋果中最豐富的多酚類物質是原花青素類[21]，而在本研究中，被測15 種蘋果汁中的酚酸含量（102～331 μg/mL）顯著高于原花青素含量（24.4～183.6 μg/mL）（P＜0.05）。這是因為原花青素水溶性低于酚酸類且光、熱不穩(wěn)定[20]，熱殺菌對其造成較大損耗；其次，酚酸類物質水溶性好[22]，在含水量高的果汁體系中溶解度高，且酚酸中綠原酸是蘋果中最主要的單體酚[19，23]。以上因素導致蘋果汁中含量最高的是酚酸大類物質。由圖4可以看出，蘋果汁中黃酮類物質含量最低，這是因為蘋果中黃酮類物質主要分布在蘋果果皮中，果皮中的含量約為果肉中的2～3 倍[24]。黃酮類物質中槲皮苷的含量最高，為1.4～21.2 μg/mL，這與前人[23]研究結果（0.4～27 μg/mL）相近。

2.2 15 種NFC 蘋果汁的抗氧化性

不同的抗氧化能力評價方法的反應機制和特性不同，其結論往往不同[25]。一種方法不能全面體現(xiàn)果汁系統(tǒng)中復雜的生化反應，需使用至少兩種方法進行體外抗氧化能力的測定。本研究采用DPPH 法和ABTS 法對15 種蘋果的抗氧化能力進行測定，15 種NFC 果汁的抗氧化能力見表3。

2.2.1 DPPH 的自由基清除能力 DPPH 是一種氮族自由基，易與具有氫原子供體的物質（本文中為蘋果中的抗氧化成分）發(fā)生電子轉移[26]。DPPH通過與抗氧化劑反應，自身被還原成聯(lián)氨，溶液顏色由紫色變?yōu)闇\黃色，結果可由分光光度計定量[27]。DPPH 自由基清除試驗具有自由基穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好和受環(huán)境影響小的優(yōu)點，在體外測定果蔬汁及其提取物的抗氧化能力方面具有良好的性能[28]。此外，由于DPPH 在測定淺色樣品時具有較高的準確度，因此很適合測定本試驗中的蘋果汁樣品[26]。

DPPH 試驗結果顯示，15 種蘋果汁對DPPH自由基均有不同的清除效果，其中 “喬納金”的DPPH 自由基清除能力最高（89.1%），“新世界”的清除能力最低（78.3%）?！靶录t星”、“玉華早富”、“元帥”、“秦艷”、“紅玉”、“喬納金”、“自由”和“富士”對自由基的清除率都大于85%，屬于DPPH 自由基清除能力較強的品種。

2.2.2 ABTS 的自由基清除能力 ABTS 自由基陽離子清除能力試驗是利用比色法來定量樣品中的抗氧化活性物質對ABTS 自由基陽離子的清除能力[26]。ABTS 自由基陽離子易溶于水，很適合對果汁體系進行抗氧化能力測定。此外，果汁體系中多酚種類多且反應復雜，ABTS 試驗方法可避免待測樣品中過氧化物對自由基的影響，適用于復雜混合物體系中不同抗氧化物質的抗氧化能力測定[28]。

本研究中ABTS 清除能力數(shù)據略高于DPPH值，不同品種NFC 蘋果汁的ABTS 自由基清除率為80.3%～92.6%，其中，“秋香”的ABTS 自由基清除能力最高，達92.6%，其次還有“富士”和“桔蘋”。

對ABTS 和DPPH 測定結果顯示，DPPH 自由基清除試驗中“喬納金”表現(xiàn)最好，而ABTS 自由基清除試驗中“秋香”的清除能力最強。綜合兩種抗氧化能力進行分析，“富士”、“元帥”、“玉華早富”3 個品種在兩個試驗中都表現(xiàn)為較高的自由基清除率（＞85%），“新世界”、“粉紅女士”、“秦冠”和“涼香”品種的抗氧化能力都較低。這一結果再次說明用多種試驗方法進行抗氧化能力測定的必要性。通過多種試驗對比，可以得到較為全面、可信的試驗結果。

2.3 15 種NFC 蘋果汁中單體酚與抗氧化能力的相關性分析

對不同品種的NFC 蘋果汁中酚類組成與抗氧化能力（DPPH 和ABTS 自由基清除能力）進行相關性分析，確定對總抗氧化能力起主要作用的單體酚，結果如圖5所示。相關系數(shù)（R2）取值范圍在-1～1 之間，相關系數(shù)絕對值越高，該指標對抗氧化能力的貢獻就越大。圖5中的雙標圖的橫、縱坐標分別代表各酚類成分與DPPH 和ABTS 的相關系數(shù)，其中內圓和外圓代表的相關系數(shù)（R2）分別為0.4 和0.6。本研究中以相關系數(shù)系數(shù)絕對值在0.4～0.6 范圍時，表示該酚類成分與自由基清除能力中等程度相關；相關系數(shù)絕對值0.6～0.8 范圍時，表示該酚類成分與自由基清除能力相關性強；相關系數(shù)絕對值在0.8～1.0 范圍時，表示該酚類成分與自由基清除能力相關性極強。

2.3.1 單體酚與DPPH 自由基清除能力的相關性

圖5 酚類組成與DPPH 和ABTS 值的相關系數(shù)雙標圖Fig.5 Biplots visualising the correlation between polyphenolic constituents and DPPH and ABTS values

蘋果汁的三大類多酚中，原花青素含量和DPPH 值正相關性強（R2=0.64），說明原花青素大類對DPPH 自由基清除能力貢獻率最大，同時，其含量高達總酚的32.4%，居于蘋果汁中的第2 位。原花青素的高相關性和高含量決定了其對抗氧化能力的重要作用。原花青素大類中，有3 種單體酚（原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯）與DPPH 值呈強正相關，它們對DPPH 自由基清除能力貢獻較大。在前人[30-31]的研究中也找到類似的結論。表兒茶素的相關性顯著大于兒茶素（P＜0.05），說明表兒茶素具有更高的DPPH 自由基清除能力，這是由于碳環(huán)上碳3 位的順式羥基集團比反式結構更能增強混合物的還原能力[19]。酚酸大類與DPPH 值呈強負相關（R2=-0.6）。通過分析酚酸大類組成發(fā)現(xiàn)，這是因為酚酸中的單體酚綠原酸與DPPH 自由基清除能力呈強負相關（R2=-0.63），且其含量最高，超過蘋果汁中總酚的一半。然而，這不意味著綠原酸的存在會降低果汁的抗氧化能力，只是其含量上的增加會降低抗氧化能力與總酚含量的比值?？偡又笖?shù)與DPPH 值呈負相關，這是因為酚酸大類物質占蘋果汁比重很高且呈負相關。與前人[32]對“嘎啦”蘋果果肉的總黃酮測定結果相似。本試驗的蘋果汁中黃酮含量較少，且與抗氧化能力間無顯著相關性，其中的單體酚物質根皮苷與DPPH 值幾乎沒有相關性，說明根皮苷含量對DPPH 自由基清除能力影響可以忽略。前人[19]研究顯示：根皮苷的抗氧化能力很低。也有研究顯示其抗氧化能力很高[33]。本試驗未使用高純度根皮苷分析，NFC 蘋果汁中根皮苷含量很低。雖然進行了相關性分析，但結果并不能代表根皮苷與抗氧化能力之間的關系。

總結3 類多酚的抗氧化能力，其抗氧化能力排序是原花青素＞黃酮＞酚酸，其中呈強正相關的單體酚有原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯，而綠原酸與DPPH 自由基清除能力呈強負相關。

2.3.2 單體酚與ABTS 自由基清除能力的相關性

由圖5可知，ABTS 自由基清除能力與單體酚相關系數(shù)較低，與總酚指數(shù)相關性較大，這說明該抗氧化能力主要與總酚含量有關，受單體酚種類影響較小。

生物系統(tǒng)包含多種抗氧化系統(tǒng)，它們可能參與復雜的相互作用，其中包括食物介質中的協(xié)同或拮抗反應等[34]。目前還沒有一種通用的方法能夠準確反映復雜體系中的所有抗氧化活性[25]，因此很難用某一個抗氧化試驗來說明某物質的抗氧化性能。不同抗氧化活性試驗方法具有不同的反應機理，這也是本試驗中兩種抗氧化試驗獲得結果不完全一致的原因。雖然ABTS 值與DPPH值不完全相同，但是通過比較不同多酚與ABTS的相關性，仍能發(fā)現(xiàn)相同的趨勢：三大類多酚中，原花青素是最主要的一類抗氧化物質。在原花青素大類中，對ABTS 自由基陽離子清除能力有主要貢獻的是原花青素B2、表兒茶素和兒茶素單體酚物質。此結果與DPPH 結果相同，這進一步確認了蘋果中最重要的抗氧化物質。另外，本試驗中4-羥基苯甲酸與ABTS 自由基清除能力相關系數(shù)也較高。

3 結論

15 種NFC 蘋果汁中多酚組分分析和抗氧化試驗結果顯示，NFC 蘋果汁中主要的多酚大類為酚酸和原花青素，主要的單體酚物質為綠原酸、原花青素B2 和表兒茶素，總酚指數(shù)含量最高的蘋果品種為“秋香”和“自由”?？寡趸芰Ψ治鲈u定結果：DPPH 自由基清除能力最高的品種是 “喬納金”，對ABTS 自由基清除能力最高的品種是“秋香”。單體酚和抗氧化能力的相關性分析表明，NFC 蘋果汁抗氧化能力的主要來源是原花青素大類，其中，DPPH 自由基清除能力主要與原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯3 種單體酚相關，而ABTS 自由基清除能力主要與總酚有關，與多酚組成關系不大。