陳 杉，馬雪萍，謝春梅，鄒秉杰，齊謝敏，周國華

0 引 言

血清病原學檢查是臨床普遍使用的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)檢測方法之一，但由于該方法存在檢測窗口期長及靈敏度低等限制因素易造成漏檢[1-2]。基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的HBV核酸檢測彌補了血清學檢查的不足，極大縮短了檢測窗口期，提高了HBV篩查的準確性[3-4]。然而，PCR技術需要依賴精密的升降溫設備，使其難以在資源匱乏的地區(qū)推廣使用。

近年來興起的核酸等溫擴增技術克服了對快速升降溫設備的依賴，僅需在恒定的溫度下即可實現(xiàn)對靶標核酸的高靈敏擴增檢測，非常適合于建立病原體現(xiàn)場快速檢測方法[5-6]。其中，重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)可在37～42 ℃恒溫條件下30 min內(nèi)完成高靈敏的核酸擴增[7]，比其他恒溫擴增檢測方法更有優(yōu)勢。

RPA技術通過重組酶、單鏈結合蛋白和DNA聚合酶的協(xié)同作用完成雙鏈DNA模板的指數(shù)擴增[8]。在輔助因子T4 UvsY的協(xié)助下，重組酶T4 UvsX與引物結合形成核酸-蛋白復合物，該復合物在雙鏈DNA中搜尋同源序列，一旦找到就會入侵雙鏈DNA從而引發(fā)鏈置換反應，被置換下來的互補鏈與單鏈結合蛋白結合保持單鏈狀態(tài)。隨后，重組酶從核酸-蛋白復合物中脫離，隨即與新的引物結合去開啟新的鏈置換反應，同時DNA聚合酶(Bsu)從引物末端3＇OH開始合成延伸，使兩條親本鏈繼續(xù)分離，結合正向和反向引物可同時在兩個方向合成子鏈DNA，不斷循環(huán)最終實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的指數(shù)積累。雖然RPA的擴增速度快、靈敏度高、反應條件溫和，非常適合于核酸現(xiàn)場快速檢測，但如何實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的準確檢測是RPA技術走向現(xiàn)場檢測所面臨的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的凝膠電泳方法雖然能實現(xiàn)對RPA產(chǎn)物的檢測，但操作繁瑣、開管操作易產(chǎn)生交叉污染，不適于現(xiàn)場快速檢測[8]。Exo熒光探針法是目前RPA產(chǎn)物檢測最常用的方法，它是在RPA體系中加入exo核酸外切酶III和exo探針, 利用探針特異性識別擴增產(chǎn)物進而引發(fā)外切酶切割探針產(chǎn)生熒光信號，實時監(jiān)測RPA擴增產(chǎn)物，產(chǎn)生類似于熒光定量PCR中的熒光擴增曲線，實現(xiàn)對待測靶標的高特異檢測[9-10]。然而，該方法依然需要昂貴的實時熒光檢測儀器，增加了檢測成本。雖然采用側流層析試紙條技術可對RPA產(chǎn)物進行可視化檢測[11-12]，但開管操作易產(chǎn)生交叉污染，盡管利用一次性卡套裝置可實現(xiàn)在封閉的腔體內(nèi)完成試紙條檢測過程，降低了交叉污染的風險，但每管RPA產(chǎn)物均需額外的卡套裝置無疑增加了耗材成本。因此，開發(fā)一種簡便的閉管可視化RPA檢測方法會更有利于RPA技術應用于病原體現(xiàn)場快速檢測。

本研究設計了一種RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置，RPA反應結束后將反應管放入該裝置中，通過手機拍照即可實現(xiàn)肉眼可視化判讀檢測結果。以HBV為檢測對象，根據(jù)HBV S基因特異保守序列設計RPA引物及exo探針[13-14]，采用實時熒光RPA方法優(yōu)化反應條件，建立了高效擴增HBV靶標的實時RPA擴增檢測體系，并利用研制的RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置，實現(xiàn)了30 min內(nèi)可視化檢測HBV病毒DNA，為HBV核酸快速檢測提供了新方法，也為開發(fā)基于RPA的血液HBV現(xiàn)場即時篩查平臺提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物、探針與質粒 根據(jù)HBV編碼S基因特異保守序列分別設計6條RPA上下游引物及1條探針，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。HBV(GenBank 登錄號:NC_003977)、HCV(GenBank 登錄號:NC_004102)、HIV(GenBank 登錄號:NC_001802)、TP(GenBank 登錄號:NC_010741)、H1N1(GenBank 登錄號:NC_026433.1)、H5N1(GenBank 登錄號:AF509026.2)和HPV16(GenBank 登錄號:NC_001526.4)核酸序列的質粒均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 樣本 為了驗證方法的臨床檢測可行性，收集了20份東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床HBV檢測剩余的廢棄血清樣本用于檢測。

1.1.3 儀器及試劑 血清病毒DNA提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；RPA反應試劑盒TwistAmp Liquid exo kit購自英國TwistDx公司；德國Qiagen 公司Rotor-Gene Q儀器用于等溫孵育和實時熒光信號采集。

1.2 方法

1.2.1 RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置的設計 便攜式RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置為一小體積暗盒(長、寬、高分別為112、90、100 mm)，盒內(nèi)設置有兩個包含(470±20) nm濾光片的LED激發(fā)光源，暗盒頂部設計有一個帶有(520±10) nm濾光片的信號采集窗口，將RPA擴增30 min后的反應管放置在暗盒底部，用手機在信號采集窗口拍攝反應管內(nèi)的熒光信號即可實現(xiàn)對RPA檢測結果的肉眼可視化判讀，并可通過熒光灰度值(ImageJ軟件分析)對檢測結果進行進一步的分析。整個裝置由鋰電池充電寶供電，便于現(xiàn)場使用。見圖1。

圖1 RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置示意圖

Figure 1 Schematic diagram of RPA product visualized detection device

1.2.2 RPA擴增體系的配制 在200 μL反應管中配制反應混合液，其中每個RPA反應體系為：10 μL 2×Reaction Buffer(試劑盒提供)；1.8 mmol/L dNTPs; 2 μL 10×Probe E-mix(試劑盒提供)；各0.84 μL上下游引物(10 μmol / L); 0.24 μL 探針(10 μmol / L)，渦旋混勻，加入1 μL 20×Core Reaction Mix(試劑盒提供)，顛倒混勻后，再加入0.4 μL 50×Exo(試劑盒提供)，顛倒混勻，最后將1 μL醋酸鎂(280 mmol/L，試劑盒提供)和1 μL模板加到管蓋上不同位置后，離心顛倒混勻。將配制好的反應管放入qPCR儀器中39 ℃恒溫反應30 min，每30 s讀取熒光信號1次。

1.2.3 RPA引物的篩選 針對HBV靶標分別設計了各3條上下游引物和一條探針(HBV-F1:GTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACC；HBV-F2:CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGC；HBV-F3:CTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGA；HBV-R1:AGCAGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCC； HBV-R2:CAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAG；HBV-R3：AAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAGACACATCC；HBV-probe：TGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACC[T(FAM)]CC[THF]A[T(BHQ1)]CACTCACCAACC TCT-SpacerC3。[T(FAM)]代表FAM熒光基團修飾的T堿基；[THF]代表四氫呋喃位點；[T(BHQ1)]代表BHQ熒光淬滅基團修飾的T堿基；SpacerC3為3＇端的封閉基團)。將HBV 的3條上游引物(F1、F2和F3)分別與3條下游引物(R1、R2和R3)兩兩搭配成9種組合來擴增103與102拷貝的靶標質粒DNA，選擇擴增曲線最早抬起的F1+R3作為最佳引物組合，用于后續(xù)方法的建立。

1.2.4 反應條件的優(yōu)化 用篩選得到的最佳引物探針組合分別在30、35、37、39及42 ℃這5個溫度下擴增104、103拷貝的HBV質粒模板,選擇擴增曲線最早抬起的39 ℃作為反應的最適溫度，用于后續(xù)方法的考察。

1.2.5 特異性考察 用篩選出的HBV引物探針組合來擴增HBV及其他常見的病原體HCV、HIV、TP、HPV16、H1N1和H5N1的104拷貝的質粒模板，采用可視化檢測裝置對結果進行判讀，并與實時熒光RPA法進行比較，以考察所建立方法的特異性。

1.2.6 靈敏度考察 將HBV質粒模板分別梯度稀釋至105、104、103、102、101和100拷貝，進行RPA擴增，采用可視化檢測裝置對結果進行判讀，并與實時熒光法進行比較，以考察所建立方法的靈敏度。

1.2.7 臨床樣本的檢測 根據(jù)核酸提取試劑盒(磁珠法)步驟提取血清樣本中的HBV DNA。在1.5 mL的離心管中加入25 μL 磁珠，20 μL 蛋白酶K、500 μL裂解液及200 μL樣本，60 ℃水浴15 min，混勻數(shù)次；將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，移走管內(nèi)液體；分別用700 μL洗滌液A/B 洗滌磁珠，用磁力架吸附磁珠后移走液體；用50～100 μL洗脫液重懸磁珠，65 ℃水浴5 min, 輕輕搖晃使核酸洗脫下來；最后用磁力架吸附磁珠，將液體轉移至新的無核酸酶的離心管中，-20 ℃保存。對20份血清樣本中提取到的病毒DNA進行RPA擴增，采用可視化檢測裝置對結果進行判讀，并與實時熒光法進行比較，以考察所建立方法的臨床適用性。

2 結 果

2.1 特異性考察 僅有HBV模板出現(xiàn)了比其他模板更強的肉眼可見的熒光信號，圖像灰度值計算結果也證實了這一結果；實時熒光檢測結果也僅有HBV模板產(chǎn)生了擴增曲線，HCV、HIV、TP、HPV16、H1N1和H5N1質粒模板與空白對照均未產(chǎn)生明顯的擴增曲線。見圖2。

2.2 靈敏度考察 10拷貝以上的模板均能顯示明顯區(qū)別于陰性對照的熒光信號，單拷貝模板的熒光信號也略強于陰性對照，圖像灰度值與肉眼判斷的結果一致。實時熒光擴增曲線的抬起時間隨著拷貝數(shù)降低而逐漸延長，低至101拷貝的HBV質粒模板也能產(chǎn)生良好的擴增信號曲線，單拷貝(100)數(shù)量級的靶標也有擴增信號抬起，可與陰性對照區(qū)分，表明所建立的HBV RPA檢測方法可檢測低至1-10拷貝的HBV靶標。RPA檢測HBV質粒模板的起始濃度的Log值與擴增曲線抬起時間的線性相關系數(shù)R2為0.963 3。見圖3。

2.3 臨床樣本的檢測 用肉眼即可準確判斷S1-S5為陽性樣本，S6-S10為陰性樣本，圖像灰度值與肉眼判斷的結果相同；實時熒光結果中S1-S5樣本得到了RPA擴增曲線，見圖4。表明這5例樣本為HBV陽性，S6-S10樣本無信號產(chǎn)生，表明為HBV陰性樣本。20份樣本的檢測結果與商品化qPCR試劑盒檢測結果完全一致(陽性均為11份、陰性均為9份)。初步驗證了所構建的可視化檢測裝置結合建立的HBV核酸RPA擴增法可實現(xiàn)對臨床樣本的檢測。

a:RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置檢測結果；b:熒光灰度值結果，與空白對照比較，*P<0.01；c:實時熒光信號曲線

圖2 HBV-RPA擴增法檢測多種病原體的質粒模板

Figure 2 The method of HBV-RPA detected multiple pathogens plasmid template.

a:RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置檢測結果； b:熒光灰度值結果，(與陰性對照比較，*P<0.05、**P<0.01)； c:RPA擴增實時熒光信號曲線

圖3 HBV-RPA擴增方法靈敏度檢測結果

Figure 3 Sensitivity of HBV-RPA detection method

a:RPA產(chǎn)物可視化檢測結果； b:熒光灰度值結果；c:實時熒光信號曲線

S1-S10為樣本編號；P：HBV陽性對照；N：空白對照

圖4 10例血清DNA樣本的RPA檢測結果

Figure 4 RPA results of 10 serum DNA samples

3 討 論

多年來，乙肝一直是危害我國公共衛(wèi)生安全的重大疾病之一?？焖贆z測HBV對乙肝的預防和診斷具有重要意義[15-16]。盡管熒光定量PCR法已被公認為是HBV檢測最可靠的方法，但其依賴精密的熱循環(huán)儀，不利于現(xiàn)場快速檢測。因此，基于等溫擴增的核酸檢測方法在現(xiàn)場快速病原體檢測中更受青睞[5-6]。其中，RPA技術因其反應條件溫和(37～42 ℃)、擴增速度快(15～30 min)、靈敏度高而成為核酸等溫擴增技術中的佼佼者[7-8,17]。本研究通過設計優(yōu)化HBV-RPA擴增引物與反應條件，建立了基于RPA的HBV核酸擴增方法，實現(xiàn)了在39 ℃下30 min內(nèi)對低至1～10拷貝的HBV靶標DNA的擴增檢測，也表明RPA反應相比于其他核酸擴增方法具有擴增速度快，對溫控設備的要求低，擴增靈敏度高等優(yōu)點，適合于病原體核酸現(xiàn)場快速擴增檢測。另一方面，HBV擴增檢測的RPA引物與探針的特異性良好，不會受其他可能同存在于血液中的病毒核酸序列的干擾。一般地，核酸擴增與檢測的特異性還與反應溫度有關，溫度越低其特異性往往不盡如意[18]。但RPA反應由于依賴重組酶的序列識別特性[19]，其特異性足以在較低反應溫度下區(qū)分不同序列的病原體靶標，這也為RPA進行病原體檢測提供了有力保證。

然而，傳統(tǒng)的RPA技術需要依賴實時熒光檢測設備，儀器成本高，不易推廣。RPA反應的定量性能也無法與PCR媲美，這主要由于RPA擴增完全依賴多種酶促反應的速率，其擴增動力學不像PCR那樣完全依賴于反應循環(huán)數(shù)[3]，所以很難通過擴增抬起時間對靶標進行定量。因此，采用實時熒光法監(jiān)測RPA反應不僅增加了儀器成本，而且難以準確定量，并不是RPA檢測的理想方法?；趥攘鲗游鲈嚰垪l的方法雖然實現(xiàn)了對RPA產(chǎn)物的可視化檢測，但開管操作帶來了擴增產(chǎn)物交叉污染的風險，而利用專用的防污染卡套無疑增加了耗材投入。因而，本研究設計制作了一種簡易的RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置，結合建立的HBV-RPA擴增體系，可實現(xiàn)手機拍照、肉眼即可判讀檢測HBV-RPA擴增產(chǎn)物的結果。該方法不僅極大降低了RPA應用時的儀器要求，同時避免了開管檢測導致的產(chǎn)物交叉污染的風險，進一步為開發(fā)基于RPA的病原體現(xiàn)場快速篩查技術平臺奠定了基礎。

基于RPA的HBV核酸可視化檢測方法對20份臨床血清DNA樣本的檢測結果與傳統(tǒng)的qPCR結果一致，表明該方法具有臨床應用的潛力。雖然該方法具有簡便快速、靈敏特異、儀器成本低的優(yōu)點，但難以實現(xiàn)HBV的定量，并不適用于HBV臨床治療的療效評估。但鑒于其在較低溫度下即可進行恒溫擴增，對加熱裝置的要求也十分簡單，后續(xù)可進一步改進所設計的RPA產(chǎn)物可視化檢測裝置，整合現(xiàn)場快速核酸提取和恒溫加熱模塊，將進一步為開發(fā)血液HBV現(xiàn)場快速篩查檢測平臺提供有力的技術支撐。