張 帆，方 星，徐美玲，張 瑜，高 平，趙 強(qiáng)，孫曉東，桑 明，王普清

0 引 言

帕金森病是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，在65歲以上中國(guó)人群的發(fā)病率約為1.7%[1-2]，其典型病理改變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡和α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)的聚集，臨床表現(xiàn)包括多種運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀[3]。帕金森病的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，患者腸道功能失調(diào)發(fā)生的時(shí)間通常要早于運(yùn)動(dòng)癥狀，且腸道在a-Syn的生成和擴(kuò)散過(guò)程中具有重要作用[4]，因此部分患者的帕金森病可能起始于腸道。腸道菌群能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、α-syn聚集以及運(yùn)動(dòng)功能損害[5]，提示腸道菌群可能在疾病的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)帕金森病患者腸道中普雷沃氏菌科和腸道普氏菌降低[6-7]，但國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究尚未達(dá)成共識(shí)；且當(dāng)前的主要研究方法是16S rRNA測(cè)序，對(duì)于腸道菌群的分析具有一定的局限性[8]。本研究旨在分析帕金森患者腸道普氏菌的改變，探究其在疾病中的作用以及其對(duì)疾病的潛在診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年6月至2018年1月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的46例帕金森病患者為帕金森組，及46例患者的健康配偶為對(duì)照組。帕金森組男26例，女20例，平均年齡(63.6±6.9)歲；對(duì)照組男20例，女26例，平均年齡(63.8±7.0)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)2015年帕金森病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(Movement Disorder Society Clinical Diagnostic Criteria for Parkinson′s disease, MDS-PD Criteria)[9]診斷為原發(fā)性帕金森??；帕金森病患者和健康配偶均長(zhǎng)期(>3年)共同居于襄陽(yáng)地區(qū)，且近半年無(wú)外出旅游記錄。排除標(biāo)準(zhǔn)：①糖尿病病史；②嚴(yán)重胃腸道疾病或手術(shù)史；③明顯精神疾病病史；④近3個(gè)月服用過(guò)抗生素。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào)：2017GCP0531)，受試者簽署知情同意書(shū)。所有研究對(duì)象均收集性別、年齡、飲食習(xí)慣信息，同時(shí)收集患者的臨床資料，包括發(fā)病年齡、病程、家族史、非運(yùn)動(dòng)癥狀、帕金森病評(píng)定量表(unified Parkinson′s disease rating scale, UPDRS)及H-Y分期。

1.2 糞便收集和DNA提取 囑受試者于清晨留取糞便，收集糞便于糞便微生物保存容器(上海微基公司)中，震蕩混勻后迅速置于-80 ℃冰箱凍存。稱(chēng)重250 mg糞便用于DNA提取, DNA提取流程參照試劑盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit, 德國(guó)Qiangen公司)說(shuō)明書(shū)，所有操作均在冰上進(jìn)行。利用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格的DNA保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 宏基因組測(cè)序 微生物DNA在干冰冷藏下運(yùn)輸至武漢華大基因公司，將樣本隨機(jī)打斷后得到350 bp左右的片段，3′端加上“A”堿基，兩端加上文庫(kù)接頭后進(jìn)行線性擴(kuò)增。取適量擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離和環(huán)化處理，質(zhì)控合格后利用華大測(cè)序平臺(tái)BGISEQ-500進(jìn)行高通量測(cè)序，生成原始數(shù)據(jù)。

1.4 生物信息分析 首先通過(guò)FastQC(v 0.11.8)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，下一步利用bowtie2(v 2.3.5.1)去除宿主序列，索引序列為UCSC(University of California Santa Cruz)人類(lèi)參考基因組的hg38版本。去宿主的序列參照MetaPhlAn[10]流程以得到物種豐度信息。把年齡分為<60歲、60～70歲、>70歲，分別比較各年齡段的豐度差異。參照HUMAnN2(The HMP Unified Metabolic Analysis Network 2, v 0.99)[11]流程分析功能基因和代謝通路組成。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群組成差異 共鑒定出8個(gè)門(mén)、19個(gè)綱、29個(gè)目、60個(gè)科及142個(gè)屬和399種已知細(xì)菌。進(jìn)一步從2組樣本的種水平維恩圖顯示,帕金森組、對(duì)照組分別鑒定出334、369種細(xì)菌，其中304種細(xì)菌為2組共有。帕金森組包含30種特有菌種，而對(duì)照組包含65種特有菌種。

根據(jù)物種相對(duì)豐度組成，分析2組間腸道菌群組成的差異顯示，平均相對(duì)豐度最高的前5的科中，帕金森組普雷沃氏菌科相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯降低(9.70%vs16.16%，P<0.05)，而擬桿菌科、腸桿菌科、瘤胃菌科和毛螺菌科差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。平均相對(duì)豐度最高的15個(gè)種中，帕金森組腸道普氏菌(8.22%)、脆弱類(lèi)桿菌(1.00%)較對(duì)照組(15.73%、3.63%)明顯降低(P<0.05)；糞便擬桿菌(7.75%)、大腸埃希菌(5.52%)、糞副擬桿菌(2.02%)較對(duì)照組(3.31%、3.31%、1.36%)明顯升高(P<0.05)。

2.2 不同年齡組間腸道普氏菌相對(duì)豐度差異 60～70歲和>70歲年齡組帕金森組的腸道普氏菌相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，并且隨著年齡的增加，帕金森組腸道普氏菌的相對(duì)豐度呈明顯下降的趨勢(shì)(P<0.05)，而對(duì)照組3個(gè)年齡段的腸道普氏菌無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 腸道普氏菌與疾病的相關(guān)性及預(yù)測(cè)價(jià)值 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腸道普氏菌與疾病的臨床特征具有明顯相關(guān)性(P<0.05)，與患者年齡、H-Y分期、UPDRS總分和UPDRS Ⅲ評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。此外，德克另支桿菌與患者年齡和H-Y分期呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而糞便擬桿菌與病程、糞副擬桿菌與H-Y分期、大腸埃希菌與年齡有明顯相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表2。選出2組間具有明顯差異且相對(duì)豐度>0.1%的菌種，然后篩選出5種重要細(xì)菌，包括腸道普氏菌、脆弱類(lèi)桿菌、德克另枝桿菌、穗狀丁酸弧菌和斯氏普羅威登斯菌。根據(jù)5個(gè)菌種的相對(duì)豐度構(gòu)建隨機(jī)森林模型用于疾病的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示ROC曲線的AUC為0.794(95% CI：0.696～0.872)，見(jiàn)圖1。

年齡對(duì)照組帕金森組<60歲12.68±6.1815.23±5.50#60～70歲18.27±6.50△4.73±0.97*>70歲14.61±4.32△1.51±0.44*#

與<60歲比較，*P<0.05；與60～70歲比較，#P<0.05；與帕金森組比較，△P<0.05

表 2 腸道菌群與臨床特征的相關(guān)性

Table 2 Correlation between gut microbiota and clinical features

菌群種類(lèi)年齡相關(guān)系數(shù)P值病程相關(guān)系數(shù)P值H-Y分期相關(guān)系數(shù)P值UPDRS總分相關(guān)系數(shù)P值UPDRS Ⅲ評(píng)分相關(guān)系數(shù)P值腸道普氏菌-0.1260.031-0.2030.392-0.0170.035-0.3770.027-0.2560.023糞便擬桿菌-0.0360.6700.0690.0140.0100.3170.2500.3020.1050.524糞副擬桿菌-0.5900.197-0.1240.497-0.1290.040-2.5760.056-1.6730.062德克另枝桿菌-1.8410.032-0.1320.691-0.2630.024-3.4620.158-1.2240.469脆弱擬桿菌0.2470.5170.0330.821-0.0240.645-0.5240.9620.1690.822大腸埃希菌-0.2350.046-0.0400.3970.0070.652-0.3530.293-0.3450.130穗狀丁酸弧菌-0.2730.226-0.1160.195-0.0470.123-0.9610.144-0.4860.270

圖 1 5種菌種對(duì)帕金森病的預(yù)測(cè)價(jià)值

Figure 1 The predictive value of 5 species for Parkinson’s disease

2.4 腸道菌群功能通路改變 帕金森組腸道中與分支酸/芳香族氨基酸降解相關(guān)通路的相對(duì)豐度如對(duì)羥基苯乙酸乙酯通路和分支酸通路較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而合成相關(guān)通路如通路-6163、完整芳香族氨基酸通路和芳香族氨基酸通路較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。帕金森組腸道功能的另一個(gè)顯著改變是γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)降解如通路-5022相對(duì)豐度和谷氨酸脫氫酶Ⅰ通路、碳水化合物代謝(葡萄糖通路)和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)代謝(通路-1533)較對(duì)照組明顯增加。在維生素代謝方面，2組均有維生素B1合成的增加，但帕金森組的合成通路(二磷酸硫胺通路、通路-6895)主要來(lái)自于大腸埃希菌，并且腸道中維生素B6合成通路(通路-7204)相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表3。對(duì)腸道普氏菌的作用進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)與之相關(guān)的功能通路，其中2組通路-5686、通路-6151和通路-7221差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

圖 2 腸道微生物功能分析

Figure 2 Functional analyze of gut microbiota

表 3 腸道菌群功能通路相對(duì)豐度的比較

Table 3 Relative abundance of functional pathways between two groups

通路對(duì)照組帕金森組對(duì)羥基苯乙酸乙酯通路0.009±0.0020.030±0.007*分支酸通路0.004±0.0010.013±0.003*通路-61631.213±0.0351.090±0.043*完整芳香族氨基酸通路1.181±0.0341.062±0.036*芳香族氨基酸通路1.179±0.0331.064±0.039*通路-50220.066±0.0110.114±0.009*谷氨酸脫氫酶Ⅰ通路0.053±0.0090.093±0.011*葡萄糖通路0.069±0.0110.107±0.015*通路-15330.025±0.0050.046±0.009*通路-72040.084±0.0140.132±0.017*

與對(duì)照組比較，*P<0.05

表 4 腸道普氏菌的相關(guān)代謝通路分析比較

Table 4 Functional pathway relate to Prevotella_copri

通路名稱(chēng)功能簡(jiǎn)介通路的平均相對(duì)豐度(%)對(duì)照組帕金森組P值通路-2942L-賴(lài)氨酸合成途徑Ⅲ0.4010.1550.101通路-5097L-賴(lài)氨酸合成途徑Ⅵ0.4060.1570.096通路-5686尿苷酸生物合成0.3830.1410.031通路-6151S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)0.4480.1660.049通路-6700喹啉生物合成0.4200.1480.080通路-7219腺嘌呤核糖核苷酸從頭合成0.4870.1840.060通路-7221鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷酸從頭合成0.4240.1550.038

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)帕金森病患者腸道中的普雷沃氏菌科及腸道普氏菌相對(duì)豐度明顯降低，與德國(guó)Bedarf等[6]的另一項(xiàng)宏基因組研究結(jié)果較為一致，目前東北[13]和臺(tái)灣[14]的相關(guān)研究同樣報(bào)道了普雷沃氏菌科和普氏菌屬在患者腸道中降低的現(xiàn)象，提示普雷沃氏菌科的降低可能是帕金森病患者腸道菌群的重要特征之一。

關(guān)于普雷沃氏菌科在帕金森病中作用機(jī)制，目前主要有2種：第一種是普雷沃氏菌科參與腸道黏蛋白的合成，其豐度降低導(dǎo)致腸道屏障損害和通透性增加，引起細(xì)菌內(nèi)毒素的暴露和腸道炎癥反應(yīng)，誘發(fā)腸道中α-syn的過(guò)表達(dá)，從而參與疾病的發(fā)生[15]。第二種是普雷沃氏菌科降低引起短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)合成減少，導(dǎo)致SCFAs對(duì)腸道神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用減弱[16]，進(jìn)而在腸道神經(jīng)炎癥和帕金森病中發(fā)揮作用。

本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腸道普氏菌等微生物與患者年齡、H-Y分期和UPDRS評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，且腸道普氏菌在內(nèi)的5個(gè)菌種對(duì)疾病表現(xiàn)出較好的預(yù)測(cè)能力，提示腸道菌群可能在帕金森病的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用，有望在疾病的診斷中發(fā)揮重要作用。

本研究通過(guò)對(duì)帕金森病患者與配偶的腸道功能進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異通路主要集中分支酸/芳香族氨基酸和γ-氨基丁酸的代謝方面?；颊吣c道中分支酸/芳香族氨基酸合成減少和降解增加將導(dǎo)致體內(nèi)芳香族氨基酸如酪氨酸水平的下降，可能引起代謝產(chǎn)物多巴胺的減少?gòu)亩谂两鹕≈邪l(fā)揮重要作用。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，正常水平的GABA有助于維持血腦屏障的緊密性和功能，而GABA的減少將導(dǎo)致腦血管內(nèi)平滑肌的松弛，可能會(huì)改變血腦屏障的通透性增加，引發(fā)血管炎癥神經(jīng)退行性病變的發(fā)生[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明帕金森病模型的紋狀體中GABA含量降低，而通過(guò)高頻刺激能夠顯著提高紋狀體中GABA含量[18]。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)合并幻覺(jué)的帕金森病患者枕葉中GABA水平明顯下降[19]。這些結(jié)果提示GABA減少可能是疾病的重要生化改變之一，并且與疾病的臨床表現(xiàn)具有一定相關(guān)性。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)腸道普氏菌的作用可能涉及尿苷酸生物合成、S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)和鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷酸從頭合成。研究證明口服尿苷酸能夠增加嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦內(nèi)突觸膜和突觸小棘，提高6-OHDA模型大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺水平和酪氨酸羥化酶活性，部分恢復(fù)多巴胺能神經(jīng)傳遞[20]。S-腺苷甲硫氨酸能夠通過(guò)提高血漿中硫化氫(H2S)水平降低小膠質(zhì)聚集和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)作用[21]。因此患者腸道普氏菌的減少將會(huì)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)傳遞和神經(jīng)保護(hù)作用的降低，參與帕金森病的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了帕金森病患者普雷沃氏菌科和腸道普氏菌的改變，探究了差異菌群與疾病臨床特征的相關(guān)性及其對(duì)疾病的預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了帕金森病患者腸道功能的改變和腸道普氏菌的在疾病中的可能作用，這些結(jié)果將有助于帕金森病相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步研究。但本研究還存在以下局限性：①樣本量較小且來(lái)自同一區(qū)域，限制了結(jié)果的廣泛適用性；②功能通路分析尚處于理論階段，缺乏一定的實(shí)驗(yàn)支持；③研究?jī)H限于單一時(shí)期，未來(lái)將嘗試對(duì)患者的不同階段進(jìn)行縱向研究。從臨床角度考慮，尋找菌群標(biāo)志物可能為疾病的早期診斷提供新方法，改變菌群組成以及特定代謝產(chǎn)物的補(bǔ)充可能為疾病的治療提供新思路。