王 妹，姜鈞耀，杜雨軒，葛曉軍

0 引 言

肺癌的發(fā)病率及死亡率均居世界前列[1-2]。其中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的發(fā)病率占肺癌發(fā)病率的80%[3]。由于早期癥狀不明顯，大部分患者檢出后已是晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機，且肺癌術(shù)后復發(fā)率較高。對于這類患者的治療主要以放化療為主[4]。然而部分患者對放化療的療效并不佳[5-6]。

吉非替尼是治療NSCLC在內(nèi)的一種靶向化療藥，其主要通過靶向作用于人類表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)從而阻斷信號向下游的傳導，抑制RAS-RAF-MEK-ERK通路的激活從而抑制細胞增殖與侵襲[7-8]。研究表明，吉非替尼通常具有良好的耐受性，并在NSCLC中具有抗腫瘤活性[9-12]；2項大型II期吉非替尼單藥治療研究對已治療的晚期NSCLC患者進行了進一步證實，吉非替尼對EGFR-TK抑制劑的治療反應可能持續(xù)長達2～3年[13-14]。然而，早期對化療敏感的患者最終都會產(chǎn)生耐藥，藥物的平均反應時間為6～8個月[15]。其耐藥的機制仍然是目前研究的熱點。

微小RNA(MicroRNA)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，長19至25個核苷酸，MicroRNA是一種結(jié)構(gòu)獨特的小型非編碼RNA，是目前公認的基因表達調(diào)節(jié)劑[16]。據(jù)報道，MicroRNA可以通過沉默靶基因mRNA的表達而負向調(diào)控多種基因[17]，每個MicroRNA可以調(diào)控多達數(shù)百個基因的表達[18-19]。MicroRNA在癌癥的進展中發(fā)生明顯變化，相對于mRNA，microRNA更有希望作為在各種疾病的診斷和治療應用中的靶目標而被使用和開發(fā)。血漿microRNA已被用于癌癥早期檢測，如結(jié)腸直腸癌等[20-21]。MicroRNA在癌癥診斷中也顯示出高靈敏度和特異性，進一步證實了其作為生物標志物的潛力。本研究通過建立對吉非替尼耐藥的亞克隆H1299、A549細胞，并進行了microRNA表達微陣列分析和功能研究，以探究NSCLC化療耐藥的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人非小細胞肺癌細胞株A549、H1299購自American Type Culture Collection，將A549、H1299細胞長期暴露于吉非替尼中建立出吉非替尼獲得性耐藥細胞系。

RPMI-1640、胎牛血清購自Life Technologies公司，吉非替尼購自AstraZeneca公司，RNase購自美國Epicentre公司，dNTP購自HyTest Ltd公司，RT緩沖液和RT引物購自Invitrogen Life Technologies公司， G-fectin購自Genolution Pharmaceutical公司，YM-100微型離心柱購自EMD Millipore公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

1.2.1 細胞傳代培養(yǎng) 非小細胞肺癌細胞A549、H1299細胞培養(yǎng)于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h更換1次培養(yǎng)基，2～3 d傳代一次，所有試驗均使用對數(shù)生長期細胞進行，所有細胞系均采用聚合酶鏈反應(PCR)方法測試支原體污染為陰性。

1.2.2 吉非替尼耐藥細胞的構(gòu)建 將吉非替尼用培養(yǎng)基稀釋為0.01 μg / mL，添加到細胞中，在含吉非替尼的培養(yǎng)基中保留2～4周，或直到細胞重新聚集為止。然后將吉非替尼濃度提高0.5～2倍。逐步增加劑量持續(xù)16～24個月，直到吉非替尼濃度達到≥10倍起始濃度，此后，將吉非替尼耐藥細胞系維持在其達到的最高吉非替尼濃度以下。

1.3 方法

1.3.1 吉非替尼對細胞活性的影響檢測 采用CCK-8試劑盒分析吉非替尼對A549、H1299細胞的活性影響：取對數(shù)期細胞進行細胞計數(shù)，以5×103密度接種于96孔板，加入180 μL不含吉非替尼的細胞培養(yǎng)基。 24 h后，向每個孔中加入20 μL 含有0.1、1、10、100、1000 μg/mL吉非替尼的培養(yǎng)基，48 h后加入含10%CCK-8的RPMI-1640培養(yǎng)基，并用全波長酶標儀檢測吸光度，GraphPad prism7軟件計算IC50。

1.3.2 細胞MiRNA表達譜分析 用TRIzol提取總RNA，并通過生物分析儀確定RNA完整性。通過YM-100微型離心柱過濾RNA樣品(5 μg)得到miRNA(<300 nt)。聚(A)聚合酶用于小RNA的3′末端添加聚(A)尾，寡核苷酸標記用于進一步的熒光標記。2種類型的標記用于標記匹配的RNA樣品。使用微循環(huán)泵在微流體生物芯片上完成雜交。雜交混合物包含100 μL的6X SSPE緩沖液(0.90 mol/L NaCl，60 mmol/L Na2HPO4、6 mmol/L EDTA，pH 6.8)和25%甲醛，溫度為34 ℃。 AxonGenePix?4000B微陣列掃描儀用于捕獲Cy3和Cy5特異性熒光雜交圖像。 ArrayPro完成數(shù)字轉(zhuǎn)換。

1.3.3 細胞內(nèi)MiRNA的表達量檢測 qPCR用于檢測miRNA表達譜， 進行qPCR以驗證從微陣列分析獲得的差異性miRNA表達譜。使用TRIzol提取總RNA，并通過生物分析儀確定RNA完整性?？俁NA作為模板，并加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)，RNase，dNTP，RT緩沖液和RT引物。將混合物在16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育40 min和85 ℃孵育5 min，以生成miRNA cDNA文庫。 U6用作內(nèi)參。隨后根據(jù)標準方案使用ABIPRISM?7900系統(tǒng)進行PCR定量。其條件為95 ℃下變性10 min，然后在95 ℃下10s，在60 ℃下延伸1 min，共循環(huán)40次。

1.3.4 MiRNA-7轉(zhuǎn)染 將細胞接種在6孔板中，加入含有10%FBS的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基。 使用G-fectin，10 nmol 過表達mir-7的質(zhì)粒(5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3′)進行轉(zhuǎn)染。 并設(shè)置的空載RNA序列(5′-AAC AGT CGC GTT TGC GAC TGG-3′)作為陰性對照。 轉(zhuǎn)染3 d后，換為不含miR-7的培養(yǎng)基。在初次轉(zhuǎn)染后的第5天，使用qPCR對miR-7的表達水平進行評估。qPCR的引物序列如下：正向5′-GGGCCCGCTCTAGACT CGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG-3′，反向5′-CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTC

GAGGCTGATC-3′。

1.3.5 Mir-7的靶標預測 TargetScan(http://www.targetscan.org/)、Microcosm Targets(http：// www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)和microRNA.org(http：/ /www.microrna.org/microrna/home.do)用于計算miRNA靶標預測。

1.3.6 EGFR的表達檢測 加入細胞裂解液提取細胞蛋白，以13 500×g離心10 min去除細胞碎片，BCA法測量蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白緩沖液混勻放置100 ℃ 取30 μg增量后的蛋白上樣，80 V電泳2 h，20 V轉(zhuǎn)膜45 min進行半干轉(zhuǎn)，應用5%脫脂牛奶/BSA封閉1 h。加入EGFR一抗，4 ℃孵育，次日用TBST清洗3遍，每遍10 min，加入對應二抗，再用TBST清洗3遍，每遍10 min，顯色曝光。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌細胞對吉非替尼的IC50檢測 通過CCK-8法檢測，A549、H1299細胞的IC50分別為2.05 μg/mL、1.87 μg/mL，A549、H1299吉非替尼獲得性耐藥細胞的IC50分別為6.81 μg/mL、6.89 μg/mL，吉非替尼獲得性耐藥肺癌細胞的IC50是非耐藥細胞的3倍。見圖1。通過CCK-8法檢測細胞的IC50結(jié)果顯示，在不含吉非替尼的培養(yǎng)基中維持3周后，A549、H1299耐藥細胞的 IC50不變(6.75 μg/mL、6.73 μg/mL)。

圖 1 A549、H1299細胞與其獲得性吉非替尼耐藥細胞對吉非替尼的IC50值

Figure 1 A549 and H1299 control cell line and resistant cell line response to gefitinib treatment

2.2 耐藥前后的細胞形態(tài)觀察 與A549及H1299非耐藥細胞比較，其耐藥細胞生長較為緩慢，細胞形態(tài)擴大且扁平，耐藥細胞類似于衰老細胞。耐藥細胞暴露于高濃度的吉非替尼中細胞表現(xiàn)為急性喪失，偽足增加。見圖2。

圖 2 耐藥細胞形態(tài)發(fā)生改變

Figure 2 the cell morphology of A549 and H1299 cells and their Gefitinibresistant cells line

2.3 耐藥后細胞的MiRNA譜分析 在耐藥細胞中檢測到43種miRNA的表達譜發(fā)生了顯著變化(1.98～15.0倍)，其中有25種上調(diào)的miRNA和18種下調(diào)miRNA，選取差異較為明顯的miRNA：mir-21、mir-124c、mir-181、mir-7、mir-146a、mir-145-p基因進行qPCR定量檢測，結(jié)果表明mir-21、mir-124c、mir-181明顯上調(diào)，mir-7、mir-146a、mir-145-p明顯下調(diào)，與微陣列檢測結(jié)果一致，其中mir-7變化最顯著(P<0.05)。見表1，圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-7基因后的吉非替尼耐藥細胞系的藥物敏感性分析 耐藥細胞中miR-7表達明顯低于非耐藥細胞。通過TargetScan，Microcosm Targets和microRNA.org目標預測軟件對miR-7潛在靶標進行評估結(jié)果表明，EGFR是miR-7的靶基因之一。與未轉(zhuǎn)染細胞mir-7表達量(0.84±0.10)比較，轉(zhuǎn)染過表達mir-7的質(zhì)粒后細胞(6.72±0.84)升高(P<0.05)。提取細胞蛋白，通過Western blot檢測細胞內(nèi)EGFR的表達水平發(fā)現(xiàn)，miR-7表達升高后，細胞內(nèi)EGFR表達明顯降低。表明miR-7是EGFR的負向調(diào)控因子，確定了EGFR與miR-7表達之間的相關(guān)性。見圖4。通過CCK-8法比較耐藥細胞及miR-7轉(zhuǎn)染后細胞的IC50值的變化，結(jié)果表明，H1299耐藥細胞IC50由7.23 μg/mL降低至2.46 μg/mL，A549耐藥細胞IC50由6.85降低至2.23 μg/mL(P<0.05)。見圖5。

表 1 吉非替尼耐藥與非耐藥H1299、A549肺癌細胞中microRNA的差異表達水平

Table 1 The differential expression levels of micro(mi)RNA in gefitinib resistant A549 and H1299 cells and parental cells

編號H1299名稱倍數(shù)(log2)P值A(chǔ)549名稱倍數(shù)(log2)P值1miR-2112.2400.0025miR-2112.0210.00302miR-124c11.6210.0049miR-18111.4220.00533miR-18111.1850.0153miR-124c10.9930.01874miR-2149.0730.0020miR-21410.2660.00205miR-319.0230.0401miR-318.5240.04156miR-148a8.5490.0071miR-148a8.4640.00707miR-299-5p7.9580.0251miR-299-5p8.1120.02598miR-1277.0950.0149miR-1276.7870.01469miR-6606.8520.0077miR-6606.7720.007310miR-226.4260.0135miR-226.3430.012711miR-7665.1980.0053miR-24-15.2430.004712miR-24-15.1050.0027miR-7665.1290.002313miR-7624.9760.0154miR-7625.0870.016214miR-1434.6850.0056miR-1434.6910.005315miR-1324.1940.0234miR-376a4.2560.022416miR-99a4.1560.0132miR-99a4.1410.014817miR-376a4.0930.0310miR-1324.0980.030318miR-1453.8590.0171miR-1453.6670.017019miR-125b3.5310.0028miR-125b3.1320.002520miR-130a3.2160.0069miR-130a2.9910.007321miR-423-5p2.9950.0184miR-423-5p2.8760.017422miR-4972.5240.0251miR-4972.5530.024723miR-7442.3880.0004miR-3752.4340.000824miR-3752.2580.0021miR-7442.2250.001225miR-140-3p1.9820.0338miR-140-3p1.9980.034126miR-7-14.0350.0051miR-7-15.0970.004527miR-146a-9.9610.0246miR-146a-11.9560.023828miR-142-5p-9.4580.0210miR-142-5p-9.5980.019729miR-122-7.5580.0234miR-122-7.3510.026330miR-494-5.5210.0184miR-126-5.3390.010531miR-424-5.3850.0046miR-424-5.2330.007332miR-126-5.2100.0363miR-494-5.0170.034333miR-224-4.7790.0342miR-224-4.9850.030534miR-638-4.5620.0098miR-155-4.6360.010135miR-155-4.2980.0066miR-638-4.1760.005336miR-483-3p-3.9950.0154miR-483-3p-4.0880.017737miR-92a-3.7800.0001miR-92a-3.9760.000338miR-505-3.6510.0298miR-505-3.6480.031439miR-125-3p-3.4750.0234miR-125-3p-3.1220.025540miR-572-2.9650.0259miR-572-2.4940.026341miR-100-2.3910.0181miR-100-2.3210.017742miR-720-2.2500.0105miR-720-2.1650.009343let-7e-1.9870.0121let-7e-2.0090.0107

圖 3 qPCR檢測耐藥細胞與非耐藥細胞間miRNA的差異表達

Figure 3 q PCR used to detects the differential expression of miRNA between drug-resistant and the parental

1:非耐藥細胞；2：耐藥細胞；3：耐藥細胞轉(zhuǎn)染miR-7質(zhì)粒

圖 4 Western blot檢測H1299、A549 EGFR蛋白表達

Figure 4 Western blot analysis detectedthe expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) protein in all kinds cells

圖 5 上調(diào)miR-7后耐藥細胞的IC50

Figure 5 the IC50of gefitinib resistence cells witch transfected of miR-7 gene

3 討 論

目前，化學療法仍然是治療NSCLC的主要治療方法[21-22]。然而，化學療法目前已經(jīng)遇到了瓶頸，盡管部分患者對化療藥的初始反應良好，但大多數(shù)NSCLC患者仍會發(fā)生化療耐藥和復發(fā)[23-24]。因此，需要開發(fā)新型的靶向特異性分子以減輕耐藥，對miRNA的研究使之成為可能。

已有報道關(guān)于miRNA在肺癌的藥物耐藥性中作用。此前的研究表明，miR-134/487b/655基因有助于轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)且直接靶向作用于膜相關(guān)鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinaseinverted-2, MAGI2)WW和PDZ結(jié)構(gòu)域從而影響吉非替尼的耐藥性[25]，而抑制MAGI2導致肺癌細胞磷酸酶和張力蛋白同源物喪失穩(wěn)定性，這提示miR-134/miR-487b/miR-655簇可能是晚期肺腺癌患者的新型潛在治療靶標。 Dong等[26]表明，與對順鉑敏感的細胞系相比，在順鉑耐藥的肺癌細胞系中miR-31明顯上調(diào)。 An等[27]使用miRNA芯片分析鑒定出經(jīng)Rh2處理后的A549細胞與未處理的A549細胞相比，有24種miRNA存在明顯的差異表達。還檢測到miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在吉非替尼刺激的NSCLC細胞中異常表達，這可能在吉非替尼誘導的NSCLC細胞凋亡和EMT中起重要作用[28]。這些作用可能是通過抑制BCL2、凋亡肽酶激活因子1、蛋白激酶Cε和肉瘤病毒癌基因同源物的基因的表達而介導的。

一項關(guān)于乳腺癌的研究表明，miR-7通過調(diào)節(jié)癌細胞中EGFR的表達在乳腺癌患者治療的耐藥性發(fā)展中發(fā)揮作用[29]。據(jù)報道，MiR-7還可以調(diào)節(jié)黑色素瘤細胞中IGF-1R的表達[30]。本研究中，通過微陣列技術(shù)對吉非替尼耐藥A549、H1299細胞及非耐藥細胞中MiRNA表達量的比較，篩選出差異表達較為明顯的miR-7，qPCR研究結(jié)果表明吉非替尼耐藥細胞的miR-7表達明顯降低，qPCR檢測結(jié)果與微陣列一致。本研究通過生物信息學分析軟件預測了miR-7的靶標發(fā)現(xiàn)EGFR是miR-7的主要靶標之一，通過Western blot分別檢測了2種細胞內(nèi)EGFR的表達發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞EGFR表達明顯高于非耐藥細胞，本研究結(jié)果表明，EGFR受miR-7負調(diào)控作用，并且在吉非替尼耐藥細胞中EGFR蛋白表達水平上調(diào)與miR-7的降低密切相關(guān)。

有報道，EGFR信號傳導不僅有助于腫瘤細胞的增殖，分化、抗凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)，而且還參與了疾病的進展[31]。因此，miR-7的降低導致EGFR表達升高在肺癌細胞治療的耐藥性發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，miR-7可能通過調(diào)節(jié)癌細胞中EGFR的表達。

本研究中，miRNA表達譜檢測到了吉非替尼耐藥和吉非替尼敏感的A549、H1299細胞之間的差異表達模式。在分析的miRNA基因中，有43種miRNA在細胞系之間發(fā)生了顯著改變(>1.98倍)，包括25種miRNA的上調(diào)和18種miRNA的下調(diào)。上述miRNA在細胞中的差異表達水平提示這些miRNA在NSCLC細胞耐藥性發(fā)展中作用。

本研究的局限性在于只預測了miR-7的靶目標，所用細胞系較少，后續(xù)將選用更多細胞系， 對篩選出的更多miRNA進行預測，進一步證實miRNA在細胞中的差異表達在細胞耐藥中發(fā)揮重要作用。