候愷玥，婁素琳，曾志勇，胡章立，2，李 輝，2

1) 廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點實驗室，廣東省海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060 ；2)深圳市海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，深圳大學(xué)龍華生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，廣東深圳 518060

環(huán)狀核糖核酸(circular ribonucleic acid, circular RNA或circRNA)是一類無 5′ 帽子結(jié)構(gòu)和3′ poly A 尾，以共價鍵連接形成閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子. 環(huán)狀RNA廣泛存在于包括人類在內(nèi)的真核生物界, 在生命過程中扮演著重要的調(diào)控角色[1-2]. 在植物體內(nèi)，環(huán)狀RNA參與花發(fā)育、果實成熟和逆境響應(yīng)等過程[3-4]. 在動物研究中, 有相關(guān)報道指出環(huán)狀RNA與腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)過程密切相關(guān), 能夠直接或間接調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生[5]. 此外, 環(huán)狀RNA能夠競爭性結(jié)合microRNA，發(fā)揮分子海綿的吸附作用，從而實現(xiàn)對mRNA的調(diào)控[6]. 然而，作為一種嶄新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，目前僅對動物與植物細(xì)胞中的環(huán)狀RNA進(jìn)行了有限研究，單細(xì)胞真核生物是否具有該類型的調(diào)控仍屬未知. 本研究通過組學(xué)測序分析，探究單細(xì)胞模式真核生物——萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,C.reinhardtii)是否存在環(huán)狀RNA. 硫元素作為萊茵衣藻正常生長的必需元素, 參與衣藻包括光合產(chǎn)氫在內(nèi)的眾多代謝調(diào)控途徑.課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺硫培養(yǎng)后的衣藻microRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯的差異性表達(dá)[7-8]，本研究擬對正常與缺硫培養(yǎng)的萊茵衣藻組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，以期探究單細(xì)胞真核微藻中是否存在環(huán)狀RNA，并對營養(yǎng)脅迫進(jìn)行應(yīng)答.

1 實驗材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)條件

萊茵衣藻藻株CC849購自萊茵衣藻資源中心(https://www.chlamycollection.org/). 將萊茵衣藻CC849在 TAP(Tris-acetate-phosphate)培養(yǎng)基中培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為22 ℃, 光照強度為50 μmol/(m2·s). 將培養(yǎng)的萊茵衣藻置于恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期后, 離心收集藻細(xì)胞于TAP-S(缺硫TAP)培養(yǎng)基中重懸，TAP-S培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[9]報道的進(jìn)行配制，所有的硫元素用等物質(zhì)的量的氯元素代替. 缺硫處理24 h, 培養(yǎng)條件不變, 對照組用TAP培養(yǎng)基在同等條件下同時處理, 用于缺硫前后萊茵衣藻總RNA的提取[7-8].

1.2 cDNA文庫的構(gòu)建與環(huán)狀RNA的鑒定

用 TRIZOL法提取萊茵衣藻總 RNA, 通過核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)R消除線性RNA后, 使用SuperScriptⅢ試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA. 加入特異性引物(根據(jù)環(huán)狀RNA連接位點設(shè)計的背靠背引物), 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 擴(kuò)增得到約 100堿基對(base pair, bp)的條帶, 回收并純化后測序, 所得序列與預(yù)測環(huán)狀RNA序列相匹配即為成功分離得到的環(huán)狀RNA.

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果分析

對萊茵衣藻缺硫處理前后基因組測序得到原始測序序列, 為了保證信息分析質(zhì)量, 對raw reads進(jìn)行以下過濾后獲得clean reads：① 去除帶接頭(adapter)的reads；② 去除無法確定堿基信息的比例大于 10%的reads；③ 去除低質(zhì)量(質(zhì)量值(sound quality, SQ)≤5 的堿基數(shù)占整個 read 的 50% 以上)的 reads. 后續(xù)分析都基于 clean reads預(yù)測到的218條環(huán)狀RNA序列.

圖1 缺硫前后萊茵衣藻中環(huán)狀RNA表達(dá)量密度分布Fig.1 Distribution of circRNA expression density in TAP and TAP-S cultured C. reinhardtii

2.2 環(huán)狀RNA表達(dá)水平分析

統(tǒng)計各樣本中環(huán)狀RNA的表達(dá)量, 并運用每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射瀆取的轉(zhuǎn)錄本數(shù)(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads, TPM)進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理, 結(jié)果如圖1. 從圖1可見，萊茵衣藻在缺硫處理后, 環(huán)狀RNA表達(dá)量提高. 采用微陣列顯著性分析(significance analysis of microarrays, SAM)算法對不同組間差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異具有顯著性．圖2為不同組間存在顯著性差異表達(dá)的上調(diào)轉(zhuǎn)錄本(5個)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本(3個)，N為差異倍數(shù)．每個比較組合都會得到一個差異環(huán)狀RNA 集, 將所有差異環(huán)狀RNA集取并集后得到8條有顯著差異的環(huán)狀RNA. 萊茵衣藻在缺硫處理后, 環(huán)狀RNA表達(dá)量有顯著差異. 因此推測, 萊茵衣藻部分環(huán)狀RNA是響應(yīng)缺硫脅迫的.

圖2 萊茵衣藻缺硫前后環(huán)狀RNA的表達(dá)差異Fig.2 Differential expression of circRNA volcanoes in TAP and TAP-S cultured C. reinhardtii

3 討 論

目前，已在哺乳動物和植物中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA, 諸多報道證明環(huán)狀RNA在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用, 所以一般將環(huán)狀RNA作為腫瘤診斷標(biāo)志物, 在疾病預(yù)防和診治領(lǐng)域發(fā)揮重要作用. 本研究在萊茵衣藻中首次發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的存在, 不僅豐富了人們對環(huán)狀RNA的認(rèn)識, 也為揭示環(huán)狀RNA存在于低等單細(xì)胞微藻提供了依據(jù). 此外，本研究確認(rèn)萊茵衣藻環(huán)狀 RNA對缺硫脅迫進(jìn)行響應(yīng)，下一步將探討衣藻環(huán)狀RNA、microRNA以及靶基因之間的相互作用與調(diào)控關(guān)系，以期深入理解衣藻環(huán)狀RNA響應(yīng)缺硫的機制.