史志丹，宋培玲，郝麗芬，皇甫海燕，燕孟嬌，楊永青，吳 晶，趙麗麗，李子欽

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

油菜黑脛病是一種重要的真菌病害[1]，寄主范圍廣泛，能侵染多科植物，但主要侵染十字花科植物[2-3]。油菜黑脛病菌可以通過感染的油菜莖稈在季節(jié)與季節(jié)、作物與作物之間傳播，油菜的子葉、真葉、莖稈、根以及莢果等都有可能被黑脛病原菌侵染，造成幼苗或成株死亡并導(dǎo)致菜籽產(chǎn)量和品質(zhì)降低[4-6]。致病菌為強(qiáng)侵染型（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型（Leptosphaeria biglobosa）的復(fù)合種，強(qiáng)侵染型黑脛病菌（L. maculans）在培養(yǎng)基上的生長速度較慢，形成白色平坦菌落，分生孢子器相對較少，釋放黃色至深棕色的色素。弱侵染型（L. biglobosa）黑脛病菌在培養(yǎng)基上的生長速度較快，菌落規(guī)則，分生孢子器相對較多，但主要集中在菌落中央，菌絲的氣生部分會形成黃色或褐色的液體小滴[7-8]。因此，不同的菌株在菌株致病性強(qiáng)弱、菌落生長速度、分生孢子器產(chǎn)生的數(shù)量、色素物質(zhì)的形成和積累上都有差異。目前，在我國尚未發(fā)現(xiàn)L. maculans，但L. biglobosa 作為油菜的一種病害已經(jīng)在我國普遍發(fā)生，并對長江流域的油菜產(chǎn)區(qū)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，而對油菜黑脛病的防治工作剛剛起步[9-10]。因此，揭示黑脛病菌與油菜互作過程對于研究黑脛病的致病機(jī)理具有重要意義。筆者對黑脛病菌（L.biglobosa）T-DNA 插入突變體的主要表型進(jìn)行了鑒定，旨在為后續(xù)黑脛病菌與油菜互作機(jī)制的研究提供材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試油菜品種為甘藍(lán)型油菜青雜5 號。原始菌株黑脛病菌株（L. biglobosa）nm-1 由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離保存并經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為L. biglobosa。供試菌株是本課題組利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得的GFP 標(biāo)記的黑脛病菌突變體。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

主要試劑溴甲酚綠（Bromocresol green）、剛果紅（Congo red）、 羧甲基纖維素（Craboxy methyl cellulose）、果膠（Pectin from apple）、可溶性淀粉、脫脂奶粉均購自Biotopped 公司。培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，查比克培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 突變體生長速度測定及菌落形態(tài)觀察 接種突變體于PDA 平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7～12 d，于12 d觀察記錄菌落形態(tài)，并用十字交叉法測量菌落直徑，設(shè)3 次重復(fù)，野生型黑脛病菌株nm-1 為對照。

1.3.2 突變體產(chǎn)孢量測定 接種突變體于PDA 平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。在平板上添加3 mL 無菌水，靜置10 min 后，用載玻片輕輕刮平板表面，用雙層無菌紗布過濾獲得孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子量[11]，設(shè)3 次重復(fù)，野生型黑脛病菌株nm-1 為對照。

1.3.3 突變體致病力測定 在供試油菜子葉期采用穿刺法接種，在傷口處接種10 μL 分生孢子懸浮液，孢子懸浮液濃度為1×106個(gè)/mL。20 ℃黑暗條件下套袋保濕48 h，在16 h 光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)8 d后，以野生型黑脛病菌株nm-1 為對照，參考李欣洲[12]的油菜黑脛病病情分級標(biāo)準(zhǔn)來統(tǒng)計(jì)油菜發(fā)病情況。

1.3.4 生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)間的相關(guān)性 利用軟件SPSS 24.0 對突變體的生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3.5 突變體胞外酶檢測 將待測突變體接種于以下不同培養(yǎng)基平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)12 d。以野生型黑脛病菌株nm-1 為對照，通過比較菌落外圍透明圈的大小和有無，來檢測不同菌株間胞外酶分泌的差異，具體方法如下：（1）將待測菌株接種于含有1%脫脂奶粉的查比克培養(yǎng)基上，觀察不同菌株蛋白酶分泌的差異。（2）將待測菌株接種于含有0.1%可溶性淀粉的查比克培養(yǎng)基上，用1∶100 的I2/KI（0.08 mol/L I23.2 mol/L KI）染色10 min，依次用75%的乙醇洗脫2 次，無菌水洗脫2 次，觀察不同菌株淀粉酶分泌的差異。（3）將待測菌株接種于含有1%果膠的查比克培養(yǎng)基上，用0.005%的溴甲酚綠染色后，觀察不同菌株果膠酶分泌的差異。（4）將待測菌株接種于含有1%纖維素的查比克培養(yǎng)基上，用20 mL（0.1%）的剛果紅溶液染色20 min，依次用無菌水洗脫兩次，用20 mL NaC（l1 mol/L）脫色兩次，每次20 min。觀察不同菌株纖維素酶分泌的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體菌落形態(tài)觀察

前期試驗(yàn)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得121 個(gè)突變體，對突變體的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變體菌落形態(tài)與野生型黑脛病菌株nm-1相近，只有6 個(gè)突變體與野生型黑脛病菌株nm-1菌落形態(tài)差異較為明顯。菌落形態(tài)如圖1 所示，有3 個(gè)突變體T21、T29、T30 與野生型黑脛病菌株nm-1菌落形態(tài)有明顯差異，其中突變體T21 和T30 菌落邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，而突變體T29 在PDA 平板上培養(yǎng)12 d 后，菌落未在培養(yǎng)基上生長。與野生型黑脛病菌株nm-1 相比，突變體T34 菌絲生長狀態(tài)和孢子分布相近，突變體T1、T12、T21、T29、T30、T35的菌絲生長狀態(tài)和孢子分布具有明顯差異。突變體T1、T34、T35 產(chǎn)孢量與野生型黑脛病菌株nm-1 相近，突變體T12、T21、T30 產(chǎn)孢量比野生型黑脛病菌株nm-1 明顯減少，而突變體T29 未產(chǎn)孢。突變體在培養(yǎng)過程中均有色素產(chǎn)生，且色素顏色與野生型黑脛病菌株nm-1 相近，但突變體T12 色素顏色偏紅褐色與野生型黑脛病菌株nm-1 明顯不同。

2.2 突變體菌株生長速度

突變體菌落生長速度測定結(jié)果如圖2a 所示。各突變體的生長速度與野生型黑脛病菌株nm-1 相比均有所下降。下降幅度最大的是突變體T32，其菌落直徑為6.67 cm，與野生型黑脛病菌株nm-1（8.07 cm）相比其菌落直徑下降了18.3%。其次菌落直徑下降較多的是突變體T8、T10、T17、T30，其菌落直徑分別為7.19、6.89、7.14、7.01 cm，與野生型黑脛病菌株nm-1 的菌落直徑相比分別下降了10.9%、14.6%、11.5%、13.1%。其余突變體菌株下降幅度較小，但仍與野生型黑脛病菌株nm-1 有顯著差異（P<0.05），其中突變體T4、T34 的菌落直徑均為7.83 cm，與野生型黑脛病菌株nm-1 的生長速度最接近。

2.3 突變體菌株產(chǎn)孢量測定

突變體的產(chǎn)孢量測定結(jié)果如圖2b 所示。檢測的26 個(gè)突變體中，96%的突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 相比產(chǎn)孢量顯著下降。野生型黑脛病菌株nm-1 的產(chǎn)孢量為3.84×106個(gè)/mL，其中下降最明顯的是突變體T9、T12、T14，產(chǎn)孢量分別為0.39×106、0.36×106、0.37×106個(gè)/mL，與野生型黑脛病菌株nm-1相比分別下降了89.8%、90%、90.3%。突變體T31和T34 產(chǎn)孢量分別為3.27×106、3.11×106個(gè)/mL，與野生型黑脛病菌株nm-1 最為接近，且差異不顯著（P>0.05），只有突變體T13 產(chǎn)孢量顯著高于nm-1，為8.9×106個(gè)/mL，與野生型黑脛病菌株nm-1 相比提高了56.8%。

2.4 突變體菌株致病性測定

突變體致病性測定結(jié)果如圖2c 所示。檢測的26 個(gè)突變體中，53%的突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 相比致病力無顯著差異（P>0.05），其中突變體T3、T12、T34、T36 與野生型黑脛病菌株nm-1病情指數(shù)最接近。7 個(gè)突變體（T17、T21、T27、T28、T30、T31、T32）病情指數(shù)與野生型黑脛病菌株nm-1相比顯著上升，其病情指數(shù)分別為83.33、80.00、70.00、87.50、83.06、67.50、83.05，與野生型黑脛病菌株nm-1相比分別提高87.2%、79.7%、53.8%、96.6%、86.6%、48.4%、86.6%。突變體T2、T16、T18 的病情指數(shù)有所上升，其病情指數(shù)與野生型黑脛病菌株nm-1 相比分別提高23.0%、16.1%、24.5%。突變體T11 的病情指數(shù)與野生型黑脛病菌株nm-1 相比顯著降低，其病情指數(shù)為29.54，與野生型黑脛病菌株nm-1 相比降低33.60%。

2.5 突變體菌株生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)間的相關(guān)性

對所測突變體和野生型菌株的生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，生長速度與病情指數(shù)之間存在顯著負(fù)相關(guān)，生長速度與產(chǎn)孢量、產(chǎn)孢量與病情指數(shù)之間不存在顯著相關(guān)性（表1）。

2.6 突變體菌株胞外酶測定

表1 菌株生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)之間的相關(guān)性

突變體菌株胞外酶分泌測定結(jié)果如圖3 所示。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在添加脫脂奶粉和可溶性淀粉的查比克培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生透明圈（圖3a、圖3b），所測菌株在添加脫脂奶粉的查比克培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生分生孢子，在添加可溶性淀粉的查比克培養(yǎng)基上菌絲生長稀疏且均未產(chǎn)生分生孢子，表明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 都具有蛋白酶和淀粉酶分泌的能力，外源基因的插入對突變體蛋白酶和淀粉酶的合成與分泌無影響。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在添加果膠和纖維素的查比克培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生透明圈（圖3c、圖3d），所測菌株在添加果膠的查比克培養(yǎng)基上菌絲正常生長但未產(chǎn)生分生孢子，在添加纖維素的查比克培養(yǎng)基上菌落生長異常，菌絲稀疏并且不產(chǎn)生分生孢子，表明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 均無分泌果膠酶和纖維素酶的能力。含果膠的查比克培養(yǎng)基雖然適宜菌絲體生長，但不利于產(chǎn)孢。

3 討論與結(jié)論

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌的遺傳轉(zhuǎn)化，不能確定T-DNA 外源基因插入的位置，也不能確定插入基因的穩(wěn)定性[13]，T-DNA 的插入位點(diǎn)不同可能對病原菌的一些性狀產(chǎn)生影響，有些可能與病原菌的生長和致病性相關(guān)。因此，需要從已獲得的黑脛病菌突變體中篩選出遺傳穩(wěn)定且生物學(xué)性狀和致病性都沒有發(fā)生顯著變化的突變體菌株侵染油菜。對突變體的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)多數(shù)突變體的菌落形態(tài)與野生型黑脛病菌株nm-1 相近，只有個(gè)別突變體在色素顏色和菌落生長狀態(tài)方面有較大變異。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在菌落生長速度和產(chǎn)孢量方面相比，多數(shù)突變體的生長速度和產(chǎn)孢量都顯著下降。蓋曉彤[14]在玉米莖腐病和稻腐病的研究中表明，禾谷鐮孢菌野生型菌株的產(chǎn)孢量均高于其相應(yīng)突變體，而輪枝鐮孢菌野生型菌株的產(chǎn)孢量低于其突變體。說明對不同病原菌的突變體在產(chǎn)孢量方面表現(xiàn)不同。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 相比，突變體的致病性并沒有因產(chǎn)孢量的下降而減弱，而多數(shù)突變體產(chǎn)孢量低于野生型黑脛病菌株nm-1，但多數(shù)突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 的致病力沒有顯著差異，甚至致病性更強(qiáng)一些，只有1 株致病力是減弱的，表明黑脛病菌的致病性與產(chǎn)孢量無明顯相關(guān)性。同時(shí)對突變體和野生型黑脛病菌株的生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)孢量與病情指數(shù)之間不存在顯著相關(guān)性，但生長速度與病情指數(shù)之間顯著負(fù)相關(guān)。而王曉楠[15]在研究棉花黃萎病時(shí)其突變體產(chǎn)微菌核能力降低，致病力也顯著下降，說明棉花黃萎病菌的致病力與微菌核的產(chǎn)生可能存在一定程度正相關(guān)性。但周芳芳等[16]在對棉花黃萎病菌突變體產(chǎn)孢量、生長速度、粗毒素、致病性之間相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)四者之間不存在明顯的相關(guān)性，表明不同病原菌的突變體在致病性與表型沒有相關(guān)性。胞外酶在營養(yǎng)吸收、自我保護(hù)和入侵植物細(xì)胞等方面都有重要作用。長期以來，關(guān)于真菌胞外酶研究最多的是果膠酶和纖維素酶，除此之外，在病原菌侵染植物過程中產(chǎn)生的蛋白酶有助于病原菌穿過植物細(xì)胞壁，降解植物的相關(guān)防御蛋白[17]。本研究中獲得的突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在含脫脂奶粉和可溶性淀粉的培養(yǎng)基上均可以正常生長并產(chǎn)生透明圈，說明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 一樣，可以分泌蛋白酶和淀粉酶。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在含果膠和纖維素的培養(yǎng)基上不產(chǎn)生透明圈且不能正常生長，說明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 一樣，不能分泌果膠酶和纖維素酶。外源基因的插入不影響黑脛病菌突變體胞外酶的分泌，也沒有產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型突變體。而徐榮旗[18]在研究棉花黃萎病時(shí)發(fā)現(xiàn)，T-DNA 插入突變造成了約3%的營養(yǎng)缺陷型，說明T-DNA 的插入可能會導(dǎo)致某個(gè)合成或分解代謝基因功能的喪失，影響病原菌對某種營養(yǎng)物質(zhì)的分解利用及其生長，繼而可能影響其致病性。除添加纖維素的培養(yǎng)基外，突變體和野生型黑脛病菌株nm-1 在PDA 培養(yǎng)基上均可正常產(chǎn)孢，但在查比克培養(yǎng)基上均未產(chǎn)孢，這與郝麗芬[19]在研究不同碳源對黑脛病病原菌生長影響的結(jié)果相同。本研究最終獲得了與野生型黑脛病菌株表型相近的突變體，攜帶GFP 基因的突變體T34 可以作為野生型黑脛病菌株的替代菌株，示蹤菌株的侵染過程而進(jìn)一步研究植物與病原菌的互作機(jī)制。