張虹艷, 石曉峰,2*, 邱國(guó)玉, 王小喬, 張彩霞, 張曉萍, 吳福祥, 許曉輝, 李晨曦, 潘秀麗

(1. 蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所, 甘肅 蘭州 730050; 2. 甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院, 甘肅 蘭州 730050)

罌粟殼為罌粟科植物罌粟(Papaversomniferum)采完鴉片后的干燥成熟果殼,具有一定的成癮性,標(biāo)志性成分為罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡、蒂巴因等生物堿[1]。20世紀(jì)80年代中期以來(lái),一些不法食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者在火鍋底料、調(diào)味料、肉湯中摻用罌粟殼的現(xiàn)象屢禁不止,為此2008年12月衛(wèi)生部發(fā)出《關(guān)于開(kāi)展全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專(zhuān)項(xiàng)整治的緊急通知》,明確將罌粟殼列入首批非食用物質(zhì)名單。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的罌粟殼檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[2]、液相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-14],這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn),但共性問(wèn)題是樣品前處理繁瑣。日常監(jiān)管常用的罌粟殼膠體金卡片快檢試劑盒由于其檢出限的限制,假陰性率較高。因此建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中非法添加罌粟殼的方法顯得十分必要。

熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜(TD-ESI-MS/MS)是目前比較先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)之一,與傳統(tǒng)質(zhì)譜方法相比,檢測(cè)器相同,但是取樣方法發(fā)生較大變化,傳統(tǒng)方法需要稱(chēng)樣、提取、凈化、濃縮等前處理步驟,而該方法具有無(wú)需樣品前處理,快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)勢(shì),操作時(shí)只通過(guò)簡(jiǎn)單的金屬探針接觸固體表面或液體樣品采集待測(cè)物,以高溫加熱的方式完成探針表面吸附物質(zhì)的解吸過(guò)程,解吸后的氣相物質(zhì)分子經(jīng)載氣流軌道收束并吹送至電噴霧區(qū)域,完成離子化過(guò)程,最終進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器分析,適用于不同形態(tài)樣品的檢測(cè)[15,16]。電噴霧輔助激光解吸(electrospray-assisted laser desorption ionization, ELDI)[17]、直接實(shí)時(shí)分析(distress assessment and response tool, DART)[18]、解吸電噴霧(desorption electrospray ionization, DESI)[19]等離子源技術(shù)直接分析待測(cè)物時(shí),受樣品尺寸以及形狀限制,且有不同程度的記憶效應(yīng),DART源檢測(cè)罌粟殼還需要簡(jiǎn)單的樣品前處理[20]。相比而言,TD-ESI的優(yōu)勢(shì)在于使用探針取樣直接檢測(cè),不受樣品狀態(tài)影響,無(wú)需樣品前處理過(guò)程,沒(méi)有記憶效應(yīng),更適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速篩查。目前TD-ESI-MS/MS法已應(yīng)用于水果蔬菜中農(nóng)藥多殘留[21]、血漿中利他林的藥代動(dòng)力學(xué)[22]、保健食品非法添加物[16]以及毒品檢測(cè)[23]等方面,得到了較為滿意的應(yīng)用效果。本研究運(yùn)用TD-ESI-MS/MS技術(shù)對(duì)食品中非法添加罌粟殼的5種生物堿進(jìn)行快速定性分析,能夠縮短分析時(shí)間、減少試劑耗材消耗,降低實(shí)驗(yàn)成本,是一種快速、綠色、環(huán)保的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultivo三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司), TD-ESI離子源(山東國(guó)投鴻基檢測(cè)技術(shù)股份有限公司),金屬取樣探針材質(zhì)為鎳鉻合金,線徑0.6 mm,環(huán)直徑2 mm,總長(zhǎng)5～6 cm,伸出取樣器的長(zhǎng)度為4 cm; MS105DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司), Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)。

對(duì)照品鹽酸罌粟堿(批號(hào):171214-201205,純度:99.9% )、那可丁(批號(hào):171224-201304,純度:99.9% )、蒂巴因(批號(hào):171216-201304)、嗎啡(批號(hào):171201-201324,純度:99.1% )、可待因(批號(hào):171203-201304,純度:97.5% ),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

火鍋底料和肉湯為當(dāng)?shù)厥称钒踩闄z樣品。

1.2 混合對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5種生物堿對(duì)照品各10.00 mg,分別用0.5%甲酸甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,得到質(zhì)量濃度均為1 g/L 的5種生物堿對(duì)照品的儲(chǔ)備液,于-18 ℃冰箱中保存。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成罌粟堿、那可丁、蒂巴因質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 和嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為5.0 mg/L 的混合對(duì)照品中間液,再用乙腈稀釋至那可丁、罌粟堿、蒂巴因質(zhì)量濃度為10 μg/L,可待因、嗎啡質(zhì)量濃度為50 μg/L 的混合對(duì)照品溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1 熱解吸-電噴霧離子源條件

精密移取混合對(duì)照品溶液3 μL,用探針取樣,將待測(cè)物吸附于探針表面取樣環(huán),然后將探針插入加熱管,采用高溫加熱的方式完成探針表面物質(zhì)的解吸過(guò)程,解吸后的氣相物質(zhì)分子經(jīng)載氣流軌道收束并吹送至電噴霧區(qū)域。熱解吸-電噴霧離子源配有外置注射泵,推動(dòng)泵內(nèi)溶劑進(jìn)入離子源,通過(guò)電噴霧促進(jìn)待測(cè)物離子化,最終進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜儀檢測(cè)分析,熱解吸-電噴霧離子源工作原理如圖1所示,熱解吸-離子化-質(zhì)譜檢測(cè)整個(gè)分析過(guò)程在30 s內(nèi)即可完成。

離子源條件:注射泵流速200 μL/h,加熱解吸溫度260 ℃,注射泵溶劑為0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v)。

1.3.2 質(zhì)譜條件

正離子模式;干燥氣溫度:300 ℃;干燥氣流速:3 L/min;霧化器壓力:34.5 kPa(5 psi);毛細(xì)管電壓:4 000 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

圖 1 熱解吸-電噴霧離子源工作原理Fig. 1 Principle of thermal desorption (TD)-ESI source

1.3.3 定性分析

精密移取混合對(duì)照品溶液3 μL,通過(guò)探針取樣,按上述儀器條件進(jìn)行操作;對(duì)于固體樣品,用取樣探針的取樣環(huán)在樣品表面輕刮3～5 cm,對(duì)于液體樣品,精密移取3 μL樣品至探針取樣環(huán)。同法操作,若樣品與對(duì)照品溶液具有相同的分子離子峰和碎片離子峰,而且所選擇的碎片離子豐度比與對(duì)照品溶液的離子豐度比相一致(相對(duì)豐度>50% ,允許±10%偏差;相對(duì)豐度在20% ～50%之間,允許±15%偏差;相對(duì)豐度在10% ～20%之間,允許±20%偏差;相對(duì)豐度≤10% ,允許±50%偏差),則可判斷樣品中存在這種化合物。

表 1 5種生物堿的CAS號(hào)、化學(xué)式、監(jiān)測(cè)離子、碎裂電壓、碰撞能Table 1 CAS Nos., chemical formula, monitoring ions, fragmentor and collision energies (CEs) of five alkaloids

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1 熱解吸溫度

熱解吸裝置位于離子源的前端,熱解吸溫度對(duì)離子化效率至關(guān)重要,選擇適用于待測(cè)物的熱解吸溫度保證此溫度下離子化效率最高是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。精密移取混合對(duì)照品溶液3 μL,以不同熱解吸溫度(240、250、260、270 ℃)連續(xù)檢測(cè)3次,計(jì)算不同熱解吸溫度下總離子流圖中5種生物堿加合響應(yīng)值的平均值,依次為 31 324、35 669、45 356 和 37 888,因此選擇260 ℃為熱解吸溫度。

圖 2 注射泵不同流速對(duì)響應(yīng)響度的影響Fig. 2 Effect of different rates of pump on the response intensitySource: TD-ESI, positive; gas temperature: 300 ℃; gas flow: 3 L/min; nebulizer: 34.5 kPa; capillary: 4000 V; temperature of thermal desorption: 260 ℃; solvent of injection: 0.1% formic acid aqueous solution containing 10 mmol/L formic ammonium-acetonitrile (1∶1, v/v).

2.1.2 注射泵流速

注射泵起到傳輸待測(cè)物使其離子化的作用,流速過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響離子化的效率,流速通常設(shè)置的范圍為100～200 μL/h。精密移取混合對(duì)照品溶液3 μL,以不同注射泵流速(100、150、200 μL/h)進(jìn)樣測(cè)定,連續(xù)檢測(cè)3次,記錄總離子流圖(縱坐標(biāo)為5種生物堿加合響應(yīng)值,橫坐標(biāo)為采集時(shí)間)。結(jié)果如圖2所示,圖中顯示3個(gè)峰為連續(xù)測(cè)定3次的總離子流圖,每個(gè)峰即一次進(jìn)樣的譜圖,每個(gè)峰包含5種生物堿峰面積的加合響應(yīng);當(dāng)注射泵流速降低時(shí),注射泵內(nèi)溶劑單位時(shí)間內(nèi)帶動(dòng)待測(cè)物進(jìn)入離子源的速度降低,峰形展寬,流速越低,峰展寬越明顯;當(dāng)注射泵流速升高時(shí),峰形改善,離子化效率提高;注射泵流速為200 μL/h時(shí),可以兼顧峰形與離子響應(yīng)強(qiáng)度,因此選擇200 μL/h作為注射泵流速。

2.1.3 注射泵溶劑

分別對(duì)比水-乙腈(1∶1, v/v)、0.1%甲酸水溶液-乙腈(1∶1, v/v)、0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v) 3種注射泵溶劑對(duì)5種生物堿檢測(cè)效果的影響,發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v)作為注射泵溶劑時(shí),5種生物堿響應(yīng)強(qiáng)度最高,峰形最佳,故選擇0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L 甲酸銨)-乙腈(1∶1, v/v)作為注射泵溶劑。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取火鍋底料和肉湯空白基質(zhì),用探針的取樣環(huán)取樣,然后按1.3節(jié)儀器條件,將探針插入加熱管熱解吸,進(jìn)而進(jìn)入離子源電離并導(dǎo)入三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器,考察空白基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。結(jié)果顯示空白基質(zhì)均未檢出5種生物堿,表明空白基質(zhì)對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾,專(zhuān)屬性強(qiáng)。

2.2.2 檢出限

精密吸取混合對(duì)照品溶液適量,逐級(jí)稀釋,分別加入火鍋底料和肉湯空白基質(zhì)中,按1.3節(jié)方法操作,至恰好能滿足3倍信噪比時(shí),計(jì)算檢出限(LOD)。火鍋底料和肉湯兩種不同基質(zhì)中5種生物堿的檢出限見(jiàn)表2,其中那可丁、罌粟堿、蒂巴因3種生物堿檢出限相同,火鍋底料中嗎啡和可待因的檢出限是肉湯檢出限5 μg/kg 的2倍,究其原因可能是因?yàn)榛疱伒琢匣|(zhì)中含有較多油脂和其他固形物,說(shuō)明樣品未經(jīng)前處理直接檢測(cè),復(fù)雜的基質(zhì)成分會(huì)影響待測(cè)物的檢測(cè)靈敏度。

表 2 5種生物堿的檢出限Table 2 LODs for the five alkaloids

圖 3 肉湯中5種生物堿6次重復(fù)試驗(yàn)的譜圖Fig. 3 MRM spectra of a mixture of the five alkaloid standards in soup by six repetitive test Rate of injection: 200 μL/h; other conditions are the same as those in Fig. 2.

2.2.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性

精密吸取混合對(duì)照品溶液1 mL,加入5 g火鍋底料和肉湯空白基質(zhì)中,配制成那可丁、罌粟堿、蒂巴因含量均為2 μg/kg,可待因和嗎啡濃度為10 μg/kg 的加標(biāo)樣品,分別按1.3節(jié)下的方法操作,重復(fù)進(jìn)樣6次,結(jié)果表明,各化合物均能重現(xiàn)。圖3是肉湯加標(biāo)樣品的重復(fù)性試驗(yàn)圖譜,其中圖3a中顯示6個(gè)峰為肉湯加標(biāo)樣品連續(xù)測(cè)定6次得到的總離子流圖,每個(gè)峰包含5種生物堿的響應(yīng),圖3b-k分別為各碎片離子對(duì)的監(jiān)測(cè)譜圖,可以看出,各化合物均能重現(xiàn)。

分別在1、2、4、12、24、48 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定,每個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)樣3次,結(jié)果表明5種生物堿在1～48 h內(nèi)均可檢出,穩(wěn)定性良好,能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 罌粟殼膠體金卡片快檢試劑盒的靈敏度

在火鍋底料和肉湯空白基質(zhì)中添加5種生物堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,模擬5種生物堿質(zhì)量濃度均為5、10、20、40 μg/kg 的系列陽(yáng)性樣品,采用罌粟殼膠體金卡片快檢試劑盒進(jìn)行檢測(cè),T線與C線同時(shí)出現(xiàn)結(jié)果為陰性,T線不顯色為陽(yáng)性。兩種食品基質(zhì)的模擬陽(yáng)性樣品的快檢結(jié)果相同,結(jié)果如圖4所示,以肉湯陽(yáng)性樣品為例進(jìn)行分析,當(dāng)樣品中生物堿濃度小于20 μg/kg 時(shí),膠體金卡片顯示陰性;當(dāng)樣品中生物堿濃度等于20 μg/kg 時(shí),膠體金卡片顯示弱陽(yáng)性;當(dāng)樣品中生物堿濃度大于20 μg/kg 時(shí),膠體金卡片顯示陽(yáng)性。該檢測(cè)結(jié)果與TD-ESI-MS/MS的檢出限結(jié)果進(jìn)行比對(duì),顯示其靈敏度明顯低于熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)法。

圖 4 不同濃度生物堿膠體金卡片的快檢結(jié)果Fig. 4 Results of the five alkaloids in different contents tested by colloidal gold card

圖 5 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果Fig. 5 Detection results of the real samples Conditions are the same as those in Fig. 3.

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)與驗(yàn)證

檢測(cè)了50批次的火鍋底料和肉湯樣品,每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次;發(fā)現(xiàn)一批次雞湯為陽(yáng)性樣品,檢出那可丁、罌粟堿、蒂巴因、可待因4種生物堿成分,特征離子具有較好的重現(xiàn)性,結(jié)果見(jiàn)圖5,由于樣品未經(jīng)前處理,所以具有較高的背景響應(yīng)。為此根據(jù)DB 31/2010-2012《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測(cè)定》,采用HPLC-MS/MS對(duì)實(shí)際樣品中篩查出的該批次雞湯進(jìn)行檢驗(yàn),進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)果驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表3,說(shuō)明TD-ESI-MS/MS作為定性檢測(cè)的快篩方法與HPLC-MS/MS結(jié)果具有一致性,表明該方法可以作為前端的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查方法。

表 3 不同方法檢測(cè)5種生物堿的結(jié)果對(duì)比Table 3 Comparison for the five alkaloids tested with different methods

3 結(jié)論

本研究建立了利用熱解吸-電噴霧離子源-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)罌粟殼進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的方法,該方法對(duì)固體和液體樣品均無(wú)需前處理,操作簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,準(zhǔn)確性好,30 s內(nèi)可以完成樣品的檢測(cè);該儀器可以與車(chē)載設(shè)備聯(lián)合使用,具有較高的社會(huì)嵌入性,可對(duì)食品中非法添加物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警,從源頭降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。