張博男，陳西華，梁敏，劉婷婷，南楠，祝立權(quán)，張欣，汪坤，劉書言，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 450021)

月經(jīng)是在子宮內(nèi)分泌和旁分泌的影響下，子宮內(nèi)膜為準(zhǔn)備胚胎著床而經(jīng)歷一個增殖、分化，在胚胎未植入情況下崩解脫落的循環(huán)[1]。月經(jīng)發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，有關(guān)月經(jīng)的生理現(xiàn)象還有許多問題有待探索。1957年，Pickles[2]從人體月經(jīng)液中提取出來一種刺激平滑肌的物質(zhì)，即前列腺素(Prostaglandin，PG)。環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是PGs的限速合成酶，可以催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGs[3]。COX存在2種亞型，分別是環(huán)氧合酶-1(COX-1)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)[4]。與COX-1在許多組織中廣泛表達(dá)[5]不同的是，COX-2在如前列腺、輸卵管、卵巢和子宮等少數(shù)生殖組織中呈現(xiàn)高度誘導(dǎo)性表達(dá)[6-7]，且在生長因子或炎癥因子的刺激下，細(xì)胞中的COX-2也會被迅速誘導(dǎo)表達(dá)參與炎癥反應(yīng)[8]。相關(guān)研究顯示，通過抑制COX-2的表達(dá)可以降低小鼠胚胎的著床率和妊娠率[9]，恒河猴和狒狒的COX-2在黃體期比在月經(jīng)周期的增殖期表達(dá)更強(qiáng)烈[10-11]。此外，在人類中，COX-2在經(jīng)前期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)于排卵期[12]。這些研究提示，COX-2在月經(jīng)發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用。

由于研究無法在人體內(nèi)進(jìn)行干預(yù)實驗，而月經(jīng)發(fā)生過程只在少數(shù)物種中存在，因此月經(jīng)和子宮不規(guī)則出血等相關(guān)機(jī)制的研究受到倫理道德與實驗物種的限制。小鼠月經(jīng)樣模型的建立在一定程度上打破了這一限制條件。本研究通過建立孕酮(Progesterone)生理性撤退小鼠月經(jīng)樣模型，使用COX-2特異性抑制劑Dup-697干預(yù)小鼠，探究COX-2蛋白在子宮內(nèi)膜崩解時期的表達(dá)量變化以及COX-2在月經(jīng)發(fā)生過程中的具體作用，為揭示月經(jīng)發(fā)生機(jī)制提供線索，以及為臨床治療月經(jīng)不規(guī)則出血提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

9～10周齡的SPFII級C57BL6雌性小鼠 40只，購自維通利華(實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006)。小鼠在可控的條件下給與充足的水和食物，光照時間8∶00～20∶00，溫度為20℃±1℃。所有實驗和外科手術(shù)都得到了國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.小鼠生理性月經(jīng)樣模型的建立：依據(jù)前期研究結(jié)果建立小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型[13-14](模型組，n=10)：小鼠摘除卵巢休息一周后記為第1天，在第1～3天 9∶00皮下注射100 ng 雌二醇(E2)，在第4～6天無處理，在第7天 9∶00 皮下注射5 ng E2和50 ng 孕酮，隨后將含有孕酮的皮埋管植于小鼠背部皮下；在第8～9天 9∶00繼續(xù)皮下注射5 ng E2。在第9天11∶30，向小鼠的雙側(cè)子宮角內(nèi)注射15 μl無菌花生油以誘導(dǎo)子宮蛻膜化；在子宮蛻膜化49 h后去除孕酮皮埋管，記為取材0 h(圖1)。小鼠分別在孕酮撤退后0 h、8 h、12 h、16 h以及24 h處死，將雙側(cè)子宮固定于4%多聚甲醛或用液氮冷凍并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 小鼠月經(jīng)樣模型操作流程

2.COX-2蛋白的表達(dá)檢測：利用western blot方法分別檢測模型組小鼠子宮COX-2蛋白的表達(dá)量變化。首先，通過蛋白提取試劑盒(Invent Biotechnologies，美國)提取小鼠子宮組織蛋白并經(jīng)BCA法(Thermo Scientific，美國)測定組織中的蛋白質(zhì)濃度。蛋白總量50 μg上樣到10% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國)，5%脫脂奶粉封閉后，分別與COX-2蛋白單抗(sc-19999，Santa Cruz，美國；1∶200稀釋)以及β-ACTIN多抗(60008-1-Ig，Proteintech，美國；1∶10 000稀釋)在4℃孵育過夜，與HRP標(biāo)記的二抗(SA00001-1，Proteintech，美國；1∶5 000稀釋)進(jìn)行蛋白免疫印跡反應(yīng)，使用Gel Documentation And Image Analysis System(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技)檢測蛋白條帶和定量分析。

3.COX-2抑制試驗及分組：根據(jù)是否進(jìn)行COX-2特異性抑制劑Dup-697干預(yù)，將40只雌性小鼠分為2組：實驗組(Dup-697干預(yù)組，n=20)和對照組(n=20)。實驗組的干預(yù)方法根據(jù)前期研究[13]，在孕酮撤退的-6 h、0 h、6 h、12 h和18 h分別向?qū)嶒灲M小鼠腹腔注射劑量12.5 mg/kg的 COX-2特異性抑制劑Dup-697(Cayman，美國)，對照組小鼠在相同時間點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水。小鼠分別在孕酮撤退后0 h、8 h、16 h以及24 h處死，將雙側(cè)子宮固定于4%多聚甲醛或用液氮冷凍并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.石蠟組織切片HE染色：實驗組和對照組的小鼠子宮組織固定48 h后，制備常規(guī)石蠟切片。首先，將切片梯度水化，用蘇木素染液(珠海貝索生物)25℃染色2 min，使用1%鹽酸乙醇溶液分化2 s后浸入1%氨水中反藍(lán)40 s。隨后，用1%伊紅染液復(fù)染2 min(每次染色操作后用清水清洗3次)。梯度脫水后用中性樹膠(中杉金橋)封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

5.崩解面積計算：根據(jù)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的狀態(tài)判定子宮內(nèi)膜的崩解區(qū)域與蛻膜化區(qū)域：蛻膜化區(qū)域細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核增大變圓的狀態(tài)；崩解區(qū)域的細(xì)胞由于壞死而出現(xiàn)核固縮的現(xiàn)象。使用ImageJ軟件統(tǒng)計崩解面積與蛻膜化面積，子宮的相對崩解面積=崩解面積/蛻膜化面積×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、COX-2蛋白在小鼠月經(jīng)樣模型子宮內(nèi)膜崩解期的表達(dá)變化

Western blot結(jié)果顯示，月經(jīng)樣小鼠孕酮撤退后，COX-2蛋白表達(dá)量在0 h表達(dá)量低，8 h開始升高，在12 h～24 h顯著提高(P<0.05)，并在24 h達(dá)到最高水平(P<0.05)(圖2)。COX-2的表達(dá)趨勢與子宮內(nèi)膜破裂的進(jìn)程一致，提示COX-2在小鼠子宮月經(jīng)期可能具有重要調(diào)控作用。因此，針對COX-2進(jìn)行了抑制干預(yù)實驗。

二、COX-2抑制劑Dup-697對月經(jīng)樣模型小鼠子宮形態(tài)的影響

對照組小鼠子宮組織大體觀察顯示，孕酮撤退0 h、8 h、16 h、24 h子宮表面出血點(diǎn)逐漸增多，整體顏色逐漸加深，在24 h時呈現(xiàn)深紅色；而干預(yù)組小鼠子宮相較于對照組在同一時間點(diǎn)的出血點(diǎn)較少，并且整體顏色呈粉紅色，兩組之間的顏色差異程度隨著子宮崩解進(jìn)程的加深而增大(圖3)。

三、COX-2對月經(jīng)樣小鼠子宮內(nèi)膜崩解面積的影響

小鼠子宮切片HE染色結(jié)果顯示，干預(yù)組小鼠子宮在整個月經(jīng)崩解期大部分的蛻膜區(qū)域保持完整，僅在子宮內(nèi)膜的蛻膜化區(qū)域存在少量的崩解(圖4)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，在孕酮撤退后8 h、16 h、24 h子宮相對崩解面積分別為4.56%、8.19%和11.09%，而對照組在相應(yīng)時間點(diǎn)的子宮相對崩解面積分別為16.79%、39.84%和90.85%，與對照組相比，干預(yù)組小鼠的子宮相對崩解面積顯著降低(P<0.01)。這些結(jié)果證明抑制COX-2在小鼠月經(jīng)樣模型子宮內(nèi)膜崩解過程中的表達(dá)可以降低子宮出血程度以及減少子宮內(nèi)膜崩解面積。

A：western blot 電泳條帶；B：COX-2蛋白相對表達(dá)量；與0 h比較，*P<0.05圖2 COX-2蛋白在小鼠子宮月經(jīng)崩解期的表達(dá)

A～D：對照組小鼠子宮0 h～24 h大體形態(tài)；E～H：干預(yù)組小鼠子宮0 h～24 h大體形態(tài)圖3 孕酮撤退后各個時間點(diǎn)實驗組和對照組小鼠子宮大體形態(tài)結(jié)果

A～D：對照組小鼠子宮0 h～24 h石蠟切片HE染色結(jié)果；E～H：干預(yù)組小鼠子宮0 h～24 h石蠟 切片HE染色結(jié)果。黃色虛線內(nèi)代表子宮內(nèi)膜崩解面積，紅色方框代表高倍圖像放大區(qū)域。 低倍圖像(×40)比例尺為200 μm，高倍圖像(×200)比例尺為50 μm圖4 孕酮撤退后各個時間點(diǎn)對照組和干預(yù)組小鼠HE染色結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.01圖5 孕酮撤退后對照組和干預(yù)組小鼠子宮 不同時間點(diǎn)的相對崩解面積

討 論

女性月經(jīng)周期包含了子宮內(nèi)膜的增殖、分化以及在未受孕的狀態(tài)下出現(xiàn)的崩解與出血等現(xiàn)象[1]。在臨床上，痛經(jīng)、閉經(jīng)、子宮異常出血等疾病的發(fā)生與月經(jīng)過程聯(lián)系緊密。由于月經(jīng)的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，因此探究和了解月經(jīng)的發(fā)生機(jī)制對于治療子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病具有十分重要的意義。

本研究首先建立了月經(jīng)樣模型小鼠。根據(jù)模型小鼠的western blot結(jié)果選取了在月經(jīng)周期中表達(dá)量出現(xiàn)顯著差異的COX-2進(jìn)行抑制干預(yù)試驗。Western blot結(jié)果顯示，COX-2蛋白表達(dá)量在孕酮撤退后8 h開始顯著上升，在24 h時達(dá)到最高水平，COX-2蛋白表達(dá)量在12 h～24 h顯著提高(P<0.01)。COX-2的表達(dá)趨勢與子宮內(nèi)膜破裂的進(jìn)程一致。另外已有研究表明，COX-2蛋白定位于子宮內(nèi)膜崩解區(qū)域[15]，同樣提示COX-2在小鼠子宮月經(jīng)崩解期中促進(jìn)子宮內(nèi)膜崩解剝脫。

COX-2在炎癥因子或生長因子刺激的細(xì)胞中可快速表達(dá)，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞生長、增殖等過程。COX-2具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)多種血管生成因子表達(dá)[16-17]的作用。在月經(jīng)發(fā)生過程中，通過抑制COX-2在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，可以干擾小鼠胚胎著床以及降低小鼠妊娠率[9]；近期研究表明[18]，COX-2的表達(dá)有利于胎盤的形成。同時COX-2在經(jīng)前期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)于排卵期[12]。這些研究結(jié)果提示COX-2在子宮月經(jīng)期可能具有重要調(diào)控作用。

由于COX-2基因敲除小鼠在雌性生殖系統(tǒng)中存在許多缺陷，因此在小鼠月經(jīng)樣模型中采用藥物干預(yù)的方法代替基因敲除技術(shù)抑制COX-2。Dup-697是一種COX-2特異性抑制劑，其對COX-2的抑制作用是COX-1作用的50余倍[19]。Dup-697能夠特異性結(jié)合COX-2第523位點(diǎn)的纈氨酸，阻斷COX-2與其疏水側(cè)袋的連接，從而抑制COX-2的活性[20]。因此使用Dup-697抑制COX-2的表達(dá)成為研究COX-2在子宮組織崩解以及其他女性生殖過程中作用的重要方法。

根據(jù)western blot所提示的結(jié)果，通過使用COX-2抑制劑Dup-697來研究COX-2在小鼠月經(jīng)崩解期的作用。我們首先通過小鼠子宮大體形態(tài)評估小鼠子宮出血程度，判斷COX-2在小鼠子宮月經(jīng)崩解期的作用。子宮組織取材結(jié)果表明，Dup-697干預(yù)組小鼠子宮組織顏色相較于對照組淺，且兩組之間的差異隨著子宮內(nèi)膜崩解進(jìn)程的推進(jìn)而逐漸增大，這表明COX-2在小鼠月經(jīng)崩解期可以有效調(diào)控子宮出血。

進(jìn)一步分析COX-2抑制對子宮組織崩解的影響，我們通過HE染色對子宮組織形態(tài)學(xué)分析。結(jié)果顯示，在給予COX-2抑制劑(Dup-697)后，小鼠子宮內(nèi)膜相對崩解面積顯著降低(P<0.01)，且干預(yù)組與對照組之間的差異可能隨著崩解進(jìn)程的推進(jìn)而增大。結(jié)果說明，COX-2在小鼠月經(jīng)樣模型中參與子宮的內(nèi)膜崩解剝脫。

月經(jīng)是孕酮撤退誘導(dǎo)的生理性事件[1]。COX-2在人類[12]中以及本研究使用的小鼠月經(jīng)樣模型中，均在月經(jīng)早期被誘導(dǎo)激活。本研究中觀察到的COX-2在子宮內(nèi)膜崩解過程中的誘導(dǎo)表達(dá)，提示了COX-2在子宮內(nèi)膜崩解過程中起促進(jìn)作用。但是，COX-2的抑制并不能完全抑制子宮內(nèi)膜的崩解，其原因可能為其他信號通路共同參與調(diào)控了月經(jīng)這一過程，需要進(jìn)一步研究。

本實驗以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ)，探究了COX-2在月經(jīng)期子宮內(nèi)膜崩解過程中起到的關(guān)鍵作用。這有助于我們更好的理解月經(jīng)發(fā)生的復(fù)雜分子機(jī)制，選擇性COX-2抑制劑已用于治療臨床上的不規(guī)則子宮出血[21-24]，我們的研究將為子宮內(nèi)膜異常出血的治療提供新的策略。