何博 蘇瑋 梁雪開(kāi) 歐陽(yáng)劍 戚艷萍 黃曉斌

1廣州血液中心（廣州510095）；2廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（血液安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（廣州510095）

安全有效地儲(chǔ)存紅細(xì)胞（erythrocyte/red blood cell，RBC）是近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)輸血治療的核心［1］。盡管開(kāi)發(fā)出系統(tǒng)的存儲(chǔ)解決方案和介質(zhì)［2］，RBC的存儲(chǔ)已取得顯著進(jìn)步，但RBC 的存儲(chǔ)病變?nèi)匀皇茄獛?kù)的主要問(wèn)題。影響RBC儲(chǔ)存病變的因素，包括儲(chǔ)存時(shí)間，血液成分制造方法和獻(xiàn)血者因素［3］。目前多數(shù)研究側(cè)重于前兩個(gè)，對(duì)于獻(xiàn)血者的個(gè)體差異對(duì)儲(chǔ)存RBC 的影響研究極少。有研究［4］表明，獻(xiàn)血者具有遺傳多樣性，對(duì)紅細(xì)胞儲(chǔ)存和輸血效果具有潛在影響。雖然這種遺傳差異的臨床效果尚未確立，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明［5］。除遺傳背景外，獻(xiàn)血者性別已被證明會(huì)影響紅細(xì)胞儲(chǔ)存溶血和相關(guān)指標(biāo)［6］。有研究［7］表明，來(lái)自男性的紅細(xì)胞在冷藏保存后表現(xiàn)出應(yīng)激誘導(dǎo)溶血的易感性增加，睪酮參與此機(jī)制。最近一項(xiàng)觀察性研究顯示女性和年輕獻(xiàn)血者增加了輸血后死亡風(fēng)險(xiǎn)［8］。為了進(jìn)一步探究獻(xiàn)血者在儲(chǔ)存期間溶血易感性方面的差異，本研究納入獻(xiàn)血者因素，性別，年齡和民族對(duì)自發(fā)的儲(chǔ)存溶血的影響。

調(diào)節(jié)儲(chǔ)存紅細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一是測(cè)量?jī)?chǔ)存期間的溶血程度。溶血被認(rèn)為是RBC 儲(chǔ)存質(zhì)量改變的結(jié)果，出現(xiàn)溶血反應(yīng)出對(duì)儲(chǔ)存條件的耐受性較差［9］。本研究系統(tǒng)性的納入儲(chǔ)存溶血和滲透性溶血、氧化應(yīng)激溶血的反應(yīng)情況，反應(yīng)獻(xiàn)血者因素對(duì)儲(chǔ)存期間的紅細(xì)胞保存質(zhì)量的潛在影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性收集2016年12月至2018年12月期間4 312 名獻(xiàn)血者，98.3%（4 239）的紅細(xì)胞用于儲(chǔ)存溶血參數(shù)檢測(cè)。所有獻(xiàn)血者均按照身份證資料或者自行報(bào)告民族、年齡、性別。其余例數(shù)及數(shù)量極少獻(xiàn)血者被歸為“其他”。

1.2 血液成分制備和樣品收集使用血站標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程采集全血，離心分離血液成分［10］。紅細(xì)胞懸液保存在專(zhuān)用冰箱中，溫度在（4±2）℃。按無(wú)菌接駁從血袋中抽取15 mL 樣本置于無(wú)菌離心管中，保存32 ～35 d 用于研究。從離心管中取2 份（各1 mL）進(jìn)行溶血檢測(cè)，其中1 份自發(fā)儲(chǔ)存溶血和滲透性溶血，1 份氧化應(yīng)激溶血。

1.3 溶血檢測(cè)血細(xì)胞比容（壓積）、總血紅蛋白濃度測(cè)定嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)、操作規(guī)程執(zhí)行［11］。紅細(xì)胞2 000 r/min 離心5 min，測(cè)定上清液中血紅蛋白（Hemoglobin，HGB/Hb）含量。（1）儲(chǔ)存終點(diǎn)溶血率（%）=（1-血細(xì)胞比容）×血漿或上清液游離血紅蛋白濃度/總血紅蛋白濃度×100%。（2）紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)溶血率（%）=上清液中Hb 濃度/總血紅蛋白濃度×100%。（3）氧化應(yīng)激溶血率（%）=（OD值樣品PBS 溶液-OD值純PBS 溶液）/OD值樣品去離子水-OD值純?nèi)ルx子水）×100%。800 μL 紅細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成6.25%的紅細(xì)胞懸液，加入終濃度為50 mmol/L 偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2，2'-azobis［2-methylpropionamidine］dihydrochlo?ride，AAPH），37 ℃恒溫水浴鍋中孵育120 min，取50 μL 樣品溶液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)誘導(dǎo)樣品的上清液中血紅蛋白在540 nm 處的吸光度值（OD值）。樣品在去離子水中完全溶血時(shí)所釋放的血紅蛋白在540 nm 處的吸光度值（OD值）作為基礎(chǔ)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)以確定各組差異，定量資料的結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，以P＜0.05 為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獻(xiàn)血者基本情況4 239 名獻(xiàn)血者（不包括多次獻(xiàn)血者）性別，年齡和民族分布情況見(jiàn)表1。

表1 獻(xiàn)血者基本情況Tab.1 basic situation of blood donor ±s

表1 獻(xiàn)血者基本情況Tab.1 basic situation of blood donor ±s

民族漢族壯族瑤族回族其他男性（例）1 849 126 138 181 98女性（例）1 496 105 125 135 86男性年齡（歲）35.6±16.0 38.6±13.4 40.7±15.2 34.7±13.2 35.7±14.5女性年齡（歲）37.5±15.7 37.5±13.4 39.5±15.3 36.5±12.3 37.8±14.1

2.2 性別對(duì)溶血的影響在保存32 ～35 d 時(shí)，儲(chǔ)存溶血率平均為（0.37 ± 0.31）%，性別因素在儲(chǔ)存溶血（男性0.42%vs.女性0.34%，P< 0.001）和滲透性溶血（男性30.4%vs.女性26.0%，P< 0.001）有顯著差異，氧化應(yīng)激溶血率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見(jiàn)表2。

表2 性別對(duì)溶血的影響Tab.2 Effect of the gender on the hemolysis x±s

2.3 民族對(duì)溶血的影響壯族、瑤族在儲(chǔ)存溶血率，滲透性溶血率與漢族差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 民族對(duì)溶血的影響Tab.3 Effect of the nation on the hemolysis

2.4 溶血相關(guān)因素的多變量分析獻(xiàn)血者的性別、年齡和民族的Logistic 多因素分析，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存溶血和滲透性溶血與性別，壯族、瑤族以及年齡顯著相關(guān)。滲透性溶血中，性別、壯族、瑤族及年齡是獨(dú)立影響因素。氧化應(yīng)激溶血傾向受到年齡、性別影響，見(jiàn)表4。

3 討論

隨著臨床用RBC日益增多，安全輸血制度也在逐漸完善，以提高輸血效果，減少輸血不良反應(yīng)［12］。輸血醫(yī)學(xué)認(rèn)為RBC 溶血是RBC 儲(chǔ)存損傷的標(biāo)志［13］，因此當(dāng)RBC 膜穩(wěn)定性喪失和溶血時(shí)，輸注超過(guò)21 d 儲(chǔ)存期的紅細(xì)胞可能出現(xiàn)溶血不良反應(yīng)［14］。

研究［15］表明獻(xiàn)血者民族多樣性影響冷藏保存RBC 自發(fā)性和誘導(dǎo)性溶血，存在獻(xiàn)血者紅細(xì)胞穩(wěn)定性方面的差異。本研究中僅限于體外測(cè)量RBC溶血傾向，結(jié)果顯示男性和壯族與自發(fā)性或滲透性溶血關(guān)聯(lián)最強(qiáng)。與年輕人（年齡20 ～30 歲）相比，老年人（年齡50 ～75 歲）的紅細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化活性受損［16］。老年人紅細(xì)胞中賦予對(duì)AAPH 氧化抗性的機(jī)制不太可能與性激素有關(guān)［17］，正如兩性中觀察到的類(lèi)似趨勢(shì)所表明的那樣。多變量綜合分析后，儲(chǔ)存溶血、滲透性溶血、氧化應(yīng)激溶血傾向與性別、年齡相關(guān)。最近的調(diào)查將年齡較大獻(xiàn)血者的紅細(xì)胞輸血與輸血后死亡風(fēng)險(xiǎn)降低聯(lián)系起來(lái)，這一結(jié)果可部分解釋以上結(jié)果［18］。

表4 溶血相關(guān)因素的多變量分析Tab.4 Multivariate analysis of factors related to hemolysis

不同民族間地中海貧血發(fā)生率也存在差異［19］。本研究在壯族、瑤族的獻(xiàn)血者和滲透性溶血中觀察到緊密關(guān)聯(lián)。壯族獻(xiàn)血者的紅細(xì)胞的滲透脆弱性可能源于壯族的獻(xiàn)血者中溶血性疾?。ɡ?，鐮狀細(xì)胞病和地中海貧血）的遺傳性狀的高流行性，國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)壯族和瑤族人群地中海貧血發(fā)生率高于漢族，已知其可減少滲透性溶血［20］。另外一項(xiàng)調(diào)查也顯示壯族人群α 地中海貧血發(fā)生率也高于漢族［21］，這些研究均表明不同民族間地中海貧血發(fā)生率也存在差異，因此導(dǎo)致紅細(xì)胞滲透脆弱性的差異。

基于多變量分析的結(jié)果，儲(chǔ)存溶血、滲透性溶血主要與獻(xiàn)血者民族相關(guān)，而氧化應(yīng)激溶血傾向受獻(xiàn)血者年齡、性別影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中［22］，老年大鼠（24 個(gè)月大）與年輕大鼠（4 個(gè)月大）相比，紅細(xì)胞氧化應(yīng)激水平效果更明顯。目前的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)氧化應(yīng)激的作用，不僅存在于機(jī)體衰老中，而且存在于細(xì)胞衰老中［23］。由于氧化應(yīng)激可能性隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，因此在年齡較大獻(xiàn)血者中觀察到的對(duì)AAPH 溶血抗性的增強(qiáng)可能與多次獻(xiàn)血史和其他與年齡相關(guān)的因素部分相關(guān)，這些因素導(dǎo)致紅細(xì)胞生成的鐵可用性降低［24］。

本研究?jī)?chǔ)存期末溶血率均< 0.8%，量化了獻(xiàn)血者情況對(duì)儲(chǔ)存的紅細(xì)胞中自發(fā)和應(yīng)激誘導(dǎo)溶血的影響，并重點(diǎn)介紹紅細(xì)胞獻(xiàn)血者性狀與溶血可能的相互作用的見(jiàn)解。此類(lèi)針對(duì)國(guó)內(nèi)獻(xiàn)血員研究較少，盡管取得一定進(jìn)展，但考慮到獻(xiàn)血員群體的龐大和不確定性，許多問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究，例如精確定義與輸血高傷害風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的溶血表型，以及可能易受年齡、民族以及哪些其他因素導(dǎo)致溶血傾向。當(dāng)然，如上文所述，影響RBC 儲(chǔ)存病變的因素，包括儲(chǔ)存時(shí)間，血液成分制造方法和獻(xiàn)血者因素，還需持續(xù)本研究項(xiàng)目，期待進(jìn)一步優(yōu)化RBC 儲(chǔ)存和儲(chǔ)存病變的問(wèn)題。另外，越來(lái)越多的研究關(guān)注溶血分子及遺傳機(jī)制［25-26］，期待從流行病學(xué)延伸到機(jī)制研究改善捐獻(xiàn)者篩選的過(guò)程，并減少溶血以及與輸血相關(guān)的傷害?？傊卷?xiàng)紅細(xì)胞儲(chǔ)存病變相關(guān)的獻(xiàn)血者背景和討論中代謝生物標(biāo)志物也涉及到這一趨勢(shì)，對(duì)于溶血機(jī)制、優(yōu)化紅細(xì)胞儲(chǔ)存條件和獻(xiàn)血政策具有參考價(jià)值。