于靜 姜愛(ài)麗 張小妍 李豐玲 李連芹

濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院1病理科，2婦科，3生殖醫(yī)學(xué)科（山東煙臺(tái)264100）

子宮內(nèi)膜癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，據(jù)報(bào)道2012年在世界范圍內(nèi)約有32萬(wàn)例新發(fā)病例［1］。在美國(guó)2019年估計(jì)有61 880 例子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例，在婦女所有癌癥的新發(fā)病例中排名第4位，其中死亡人數(shù)達(dá)12 160例，發(fā)病率持續(xù)上升［2］。miRNAs是一組內(nèi)源性小的非編碼RNA，它們通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)或通過(guò)結(jié)合特定目標(biāo)基因的3'末端非翻譯區(qū)域（3'UTR）來(lái)影響多種生物過(guò)程［3-4］。最近的研究表明，miRNA 表達(dá)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用［5-7］，miRNAs 最近受到了越來(lái)越多的關(guān)注。已有多項(xiàng)研究證實(shí)組織中miRNA 表達(dá)可作為癌癥診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物［8-10］，研究證實(shí)miR?200 家族成員是癌癥重要的miRNAs，認(rèn)為miR?200家族（包括miR?200a、miR?200b、miR?200c、miR?429、miR?141）是一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，有重要的臨床價(jià)值［11-12］。

筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，miR?200c 可靶向BMI?1基因抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［13］，但目前尚未有關(guān)于miR?200c 作為診斷子宮內(nèi)膜癌的生物標(biāo)志物的研究。為了解miR?200c 對(duì)于診斷子宮內(nèi)膜腺癌及判斷預(yù)后是否具有臨床意義，在之前的細(xì)胞研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討miR?200c 在子宮內(nèi)膜腺癌血清及組織中的表達(dá)情況及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2016年1月至2018年12月濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院婦科住院手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜腺癌標(biāo)本及病例資料120 例，年齡45 ～76 歲，平均（55 ± 10.56）歲，同時(shí)收集同期在婦科門診因異常子宮出血行診斷性刮宮病理結(jié)果為增殖期或萎縮型子宮內(nèi)膜標(biāo)本100 例為對(duì)照組，年齡（43 ～72）歲，平均（50 ± 15.19）歲。對(duì)照組與組患者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入研究的患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放療、化療和激素等藥物治療，既往無(wú)其他惡性腫瘤病史。對(duì)納入研究的子宮內(nèi)膜腺癌病例根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）提供的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年提供的FIGO 分期進(jìn)行分期。詳細(xì)記錄所有納入研究的患者基本資料及臨床資料。經(jīng)過(guò)濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入研究的患者其本人或家屬均知情同意并簽訂知情同意書(shū)后進(jìn)行。

所有納入研究的對(duì)象均于手術(shù)前或診刮操作前抽取清晨空腹靜脈血5 mL，離心分離血漿后保存與-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBER Green PCR 試劑盒均購(gòu)自中國(guó)大連Takara試劑公司，miR?200c?3p 及U6 引物由中國(guó)上海吉瑪有限公司合成。熒光定量PCR 擴(kuò)增儀iQ5 系統(tǒng)進(jìn)行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄，Real?time PCR ABI 7500 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶反應(yīng)（定量PCR）。miR?200c?3p 引物序列：上游引物：UAAUACUGCCGGG?UAAUGAUGGA；下游引物：CAUCAUUACCCGGCA?GUAUUAUU。U6 引物序列：上游引物：CTCGCTT?CGGCAGCACA 下游引物：AACGCTTCACGAATTT?GCGT。

1.2.2 總RNA 的提取及qRT?PCR 檢測(cè)方法Trizol 試劑裂解組織和血清細(xì)胞方法提取總RNA，測(cè)量RNA 濃度，濃度在1.8～2.0 最佳。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序條件：25 ℃開(kāi)始30 min；42 ℃30 min；85 ℃5 min；4 ℃保存，逆轉(zhuǎn)錄后cDNA-20 ℃保存。按照SYBER Green PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR 反應(yīng)體系10 μL：U6 上、下游引物各0.25 μL，miR?200c?3p上、下游引物各0.25 μL，cDNA 6 μL，無(wú)RNA 酶DEPC 水3 μL。定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：5 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性10 s；60 ℃變性20 s；70 ℃延伸10 s；4 ℃保存。溶解曲線：95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s；60 ℃15 s；共40 個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法，以U6 為內(nèi)參。采用2?ΔΔCt法計(jì)算miRNA 相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct=Ct 目的基因?CtU6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線（ROC）評(píng)價(jià)血清及組織中miR?200c 的診斷價(jià)值。應(yīng)用多元Logistic 回歸模型分析miR?200c與子宮內(nèi)膜腺癌的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜腺癌和正常對(duì)照組患者血清和組織中miR?200c 相對(duì)表達(dá)量比較RT?PCR 方法檢測(cè)miR?200c相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、污染或引物二聚體，檢測(cè)結(jié)果可靠，見(jiàn)圖1。子宮內(nèi)膜腺癌組織和血清中miR?200c 相對(duì)表達(dá)量2?ΔΔCt平均值顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織和血清中的表達(dá)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 子宮內(nèi)膜腺癌組織及血清中miR?200c 相對(duì)表達(dá)量與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系子宮內(nèi)膜腺癌組織和血清中miR?200c 表達(dá)與臨床分期、肌層浸潤(rùn)深度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）；miR?200c 在臨床晚期、深肌層浸潤(rùn)和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌的組織中表達(dá)明顯下降，而在臨床晚期、深肌層浸潤(rùn)和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者的血清中表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。子宮內(nèi)膜腺癌組織和血清中miR?200c 表達(dá)與患者年齡和分化程度無(wú)相關(guān)關(guān)系（P> 0.05）。多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期、肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響miR?200c 表達(dá)的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2、3。

表1 宮內(nèi)膜腺癌和正常子宮內(nèi)膜組織和血清中miR?200c相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of the relative expression of miR?200c in tissues and serum of endometrial adenocarcinoma and normal endometrial x±s

圖1 miR?200c 擴(kuò)增曲線（A）和溶解曲線（B）Fig.1 Amplification curve（A）and dissolution curve of miR?200c（B）

2.3 血清和組織中miR?200c 對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌的診斷價(jià)值血清和組織中miR?200c 診斷子宮內(nèi)膜腺癌的曲線下面積（AUC）及95%CI分別為0.943（0.916 ～0.970）和0.949（0.924 ～0.973）與對(duì)照組（AUC=0.5）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。miR?200c 診斷子宮內(nèi)膜腺癌的敏感度較好，血清和組織miR?200c 敏感度分別為：76.5%和77.1%；但特異度差，分別為44.7%和30.73%。見(jiàn)圖2、表4。

表2 血清和組織中miR?200c 相對(duì)表達(dá)量與子宮內(nèi)膜腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between the relative expression of miR?200c and the clinicopathologica characteristics in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma ±s

表2 血清和組織中miR?200c 相對(duì)表達(dá)量與子宮內(nèi)膜腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between the relative expression of miR?200c and the clinicopathologica characteristics in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma ±s

臨床與病理特征年齡（歲）≤60＞60分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ分化程度G1/G2 G3肌層浸潤(rùn)＜50%≥50%淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú) 有例數(shù)28 92 93 27 85 35 91 29 87 33組織miR?200c 3.43±0.68 3.40±0.77 4.31±0.41 3.15±0.61 3.44±0.71 3.33±0.84 4.08±0.43 3.19±0.70 4.27±0.38 3.08±0.57 t 值0.192 9.393 0.705 6.422 11.01 P 值0.718 0.023 0.132 0.010 0.005血清miR?200c 2.51±0.70 2.36±0.77 2.13±0.61 3.32±0.40 2.43±0.72 2.33±0.84 2.17±0.69 3.11±0.44 2.06±0.56 3.30±0.38 t 值0.869 9.570 0.638 6.855 11.756 P 值0.752 0.014 0.151 0.014 0.003

表3 血清和組織中miR-200c 對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of miR-200c and the clinicopathological features in serum and tissues of endometrial adenocarcinoma

圖2 miR?200c 診斷效能的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of miR?200c diagnostic efficacy

表4 血清和組織中miR?200c 對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌的診斷價(jià)值Tab.4 The diagnostic value of miR?200c in serum and tissues in endometrial adenocarcinoma

3 討論

目前有研究認(rèn)為腫瘤外泌體的miRNA 表達(dá)譜與腫瘤負(fù)荷或疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，外周血液循環(huán)系統(tǒng)或淋巴液攜帶大量的miRNA且分泌具有穩(wěn)定性［14-16］。

最近有研究報(bào)道了血液循環(huán)中miRNAs 作為生物學(xué)標(biāo)志物診斷卵巢癌和評(píng)價(jià)預(yù)后的臨床相關(guān)性研究，認(rèn)為miR?200c 是鑒別診斷卵巢腫瘤最敏感、最有特異性的標(biāo)志物，甚至優(yōu)于血清CA?125［12］。目前尚未有關(guān)于miR?200c 在子宮內(nèi)膜腺癌中診斷價(jià)值的研究。

在之前的研究中筆者發(fā)現(xiàn)miR?200c靶向BMI?1基因抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，因此推斷miR?200c 可能是判斷子宮內(nèi)膜腺癌的臨床預(yù)后的分子標(biāo)志物。本研究通過(guò)檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌患者血清及組織中miR?200c 的表達(dá)，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌血清和組織中的miR?200c表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組。miR?200c在臨床晚期、深肌層浸潤(rùn)和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌的組織中表達(dá)明顯下降，而在臨床晚期、深肌層浸潤(rùn)和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌患者的血清中表達(dá)增高。此項(xiàng)研究結(jié)果與WILCZYNSKI等［17］的一致，這表明miR?200c 可能是一個(gè)潛在的預(yù)后因素，可區(qū)分早期和晚期子宮內(nèi)膜腺癌。Meta 分析數(shù)據(jù)表明，子宮內(nèi)膜實(shí)體瘤組織中miR?200c 表達(dá)的缺失和血清中miR?200c 的升高與患者生存質(zhì)量下降呈正相關(guān)［18］。本研究中miR?200c 在子宮內(nèi)膜腺癌臨床晚期和發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織和血清中的表達(dá)情況與Meta 分析的數(shù)據(jù)相同，也預(yù)示著預(yù)后不良。

miR?200c在癌癥中的診斷價(jià)值目前已有報(bào)道。KIM 等［12］研究發(fā)現(xiàn)miR?145 和miR?200c 的上調(diào)表達(dá)是鑒別診斷卵巢腫瘤最敏感和特異性的標(biāo)志物，表現(xiàn)優(yōu)于CA125。有研究報(bào)道前列腺癌患者血清中miR?200c 表達(dá)的敏感度為67%，特異度為75%［19］。本研究中miR?200c 在子宮內(nèi)膜癌患者血清中表達(dá)的敏感度高于報(bào)道中前列腺癌患者血清中的水平，特異度低于報(bào)道中前列腺癌患者血清中的水平。 Meta 分析研究發(fā)現(xiàn)，每項(xiàng)研究的樣本量、miR?200c 的檢測(cè)方法、樣本類型和患者種族不同，檢測(cè)血清中miR?200c 表達(dá)也有所不同，在胃癌患者血清中miR?200c 表達(dá)的敏感度范圍為54.5%～97.0%，特異度范圍為45.0%～100.0%［20］，因此在同種類型的癌癥患者血清中miR?200c 表達(dá)的敏感度和特異度范圍比較大。本研究發(fā)現(xiàn)miR?200c 在子宮內(nèi)膜腺癌血清中的敏感度為76.5%、特異度為44.7%，敏感度在胃癌患者血清中的表達(dá)范圍內(nèi)，特異度低于胃癌患者血清中的范圍。關(guān)于miR?200c在子宮內(nèi)膜腺癌患者血清中的表達(dá)情況尚未有其他報(bào)道，無(wú)法對(duì)比分析。目前還不清楚是否有其他因素如體內(nèi)雌激素水平影響正常子宮內(nèi)膜或子宮內(nèi)膜腺癌組織中miRNA的表達(dá)水平。KANGAS等［21］研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)體外miR 家族可以作為代謝和炎癥狀態(tài)的指標(biāo)，受更年期激素變化的影響。因此我們推斷在本研究中miR?200c 診斷子宮內(nèi)膜腺癌的敏感度可能受到了體內(nèi)雌激素水平的影響。miR?200c 在乳腺癌［22］、肺癌［23］、卵巢癌［24］、結(jié)腸癌［25］等惡性腫瘤中均表達(dá)上調(diào)，因此筆者推斷miR?200c在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，作為診斷子宮內(nèi)膜腺癌的分子標(biāo)志物特異性差。

綜上所述，已有研究證實(shí)miR?200c是診斷惡性腫瘤的分子標(biāo)志物，但本研究認(rèn)為雖然血清miR?200c診斷子宮內(nèi)膜腺癌敏感度較高但特異度較低，miR?200c 作為診斷子宮內(nèi)膜腺癌的分子標(biāo)志物證據(jù)不足。本研究在實(shí)驗(yàn)方法、樣本量較小等方面尚有很多不足之處，尚需更深入的研究來(lái)進(jìn)一步完善miR?200c作為子宮內(nèi)膜腺癌的診療評(píng)估體系。