何偉玲 李清海 嚴(yán)時(shí)佳 萬國(guó)輝

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科（廣州510080）；2中山大學(xué)藥學(xué)院（廣州510006）

缺氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)典型特征。由于腫瘤細(xì)胞的增殖不受機(jī)體調(diào)節(jié)，當(dāng)其增殖速度超過新生血管的生長(zhǎng)速度時(shí)，則會(huì)在腫瘤內(nèi)部距離血管大于180 μm（正常氧氣彌散距離）處形成一個(gè)缺血缺氧的微環(huán)境，同時(shí)由于腫瘤內(nèi)部的新生血管通行性較差，更進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境的形成［1］。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia?inducible factor，HIF）家族是低氧環(huán)境下細(xì)胞代謝改變的主要啟動(dòng)因子［2］，它由α亞基和β亞基組成，其中β亞基恒定表達(dá)，而α亞基作為主要調(diào)節(jié)亞基，自身受到氧濃度的調(diào)節(jié)［3］。絕大多數(shù)HIF 靶基因受到的是HIF?1α的調(diào)控，其誘導(dǎo)激活的信號(hào)通路參與并促進(jìn)了一系列惡性腫瘤的進(jìn)展。

研究指出，由HIF 轉(zhuǎn)錄激活因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的異常血管生成、能量代謝異常如糖酵解和線粒體功能抑制等改變更加明顯，其中糖酵解產(chǎn)生的乳酸等酸性代謝產(chǎn)物聚集又可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的pH 值下降，進(jìn)一步激活更多與腫瘤代謝相關(guān)的酶［4］；此外，缺氧環(huán)境還誘導(dǎo)了許多腫瘤特異性的改變，如抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化修飾［2］、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞免疫抑制表型的形成和免疫逃逸［5-7］、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［8］、促進(jìn)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成［9］、促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移點(diǎn)腫瘤細(xì)胞的存活［10］等，在以上缺氧誘導(dǎo)性改變的共同作用下，腫瘤細(xì)胞可發(fā)生不同程度的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和以放療為主的治療抵抗，使患者預(yù)后不良。但同時(shí)也有報(bào)道指出，HIF 有時(shí)也可對(duì)腫瘤起負(fù)調(diào)控作用，參與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［11］。

結(jié)腸癌（colorectal cancer）在傳統(tǒng)的化療聯(lián)合靶向治療方面取得了巨大的進(jìn)展，但目前最大的挑戰(zhàn)仍是藥物的耐藥性問題［12］，其中低氧HIF 對(duì)不同藥物在腫瘤中產(chǎn)生獲得性耐藥起著至關(guān)重要的作用。隨著分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，陸續(xù)有學(xué)者提出靶向HIF 的腫瘤治療策略，但HIF 的異型性行為是這種策略實(shí)施的主要障礙［13-14］，因此更清晰了解HIF 的作用機(jī)制尤其是在腫瘤細(xì)胞負(fù)性調(diào)控機(jī)制尤為重要。本研究通過系統(tǒng)比較結(jié)腸細(xì)胞在常氧低氧中表達(dá)差異的基因，通過基因富集分析首次發(fā)現(xiàn)在低氧培養(yǎng)的結(jié)腸癌中與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ（fucosyltransferase 4，F(xiàn)UT4）基因表達(dá)下調(diào)，預(yù)示了結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞代謝相關(guān)信號(hào)通路的異常和對(duì)潛在耐藥性的影響，并進(jìn)一步探索了HIF?1α對(duì)其具體的負(fù)性調(diào)控機(jī)制及病理生理意義。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器基因表達(dá)芯片（GSE77606，基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）），HCT?116 和HT?29 細(xì)胞系（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC），杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）（Corning，美國(guó)），10%FBS，支原體染色試劑盒（C0296，Beyotime，中國(guó)），GenePrint 10系統(tǒng)（B9510，Promega，美國(guó)），HIF?1α 特異性的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，Quick ChangeⅡ定點(diǎn)突變?cè)噭┖校?00523，Agilent，美國(guó)），pCDH?puro 慢病毒載體（CD510B?1，System Biosciences），8mg/ml 溴化己二甲胺（TR?1003，Sig?ma），1 μg/mL 嘌呤霉素，Trizol 試劑（ThemoFisher，美國(guó)），PrimeScript RT 試劑盒（RR036A，Takara，日本），熒光染料SYBR?Green（RR820B，Takara，日本），雙熒光素酶載體pmiGLO（C838A，Promega，美國(guó)），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（RG028，Beyotime，中國(guó)），微小RNA（microRNA，miRNA）模擬物，miRNA 拮抗劑，各類引物和低氧培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 芯片數(shù)據(jù)分析從GEO 中篩選并下載符合研究條件的芯片（GSE77606），隨后使用R 語(yǔ)言（3.4 版本，http：//www.bioconductor.org）的edgeR 包對(duì)其進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。基因表達(dá)差異用log2 fold change（log2FC）計(jì)算，當(dāng)log2FC ≥1、log2FC <-1 和P< 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用在線工具KOBAS.3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）和DAVID 6.8（http：//david.ncifcrf.gov）對(duì)差異基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，探討差異表達(dá)基因的激活途徑，P<0.1認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.mirdb.org）篩選出與目的基因mRNA 的3'端非翻譯區(qū)（3'untranslated region，3'?UTR）互補(bǔ)的miRNA 以及在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Altas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中查找并分析原始結(jié)腸癌標(biāo)本中目的基因的表達(dá)情況。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)HCT?116 和HT?29 細(xì)胞系來源于ATCC，并培養(yǎng)在37 ℃條件下、含10%FBS 和5%CO2的DMEM 中。并使用支原體染色試劑盒檢測(cè)有無支原體污染。同時(shí)使用GenePrint 10 系統(tǒng)的STR 分析對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，具體操作參照制造商的說明書執(zhí)行。缺氧條件下的細(xì)胞系培養(yǎng)在低氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行，箱內(nèi)具體氣體含量參數(shù)為1%的O2，5%的CO2和94%的N2。

1.2.3 引物及shRNA 設(shè)計(jì)通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Infor?mation，NCBI）基因庫(kù)查找相應(yīng)的基因序列，并按照引物及干擾RNA 設(shè)計(jì)基本原則，設(shè)計(jì)出目的基因、對(duì)應(yīng)的miRNA 和HIF?1α 的引物序列及HIF?1α?sh RNA 序列。

1.2.4 定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse tran?scription PCR，QRT?PCR）采用Trizol 試劑分離RNA，具體操作參照制造商的說明書執(zhí)行，并使用PrimeScript RT 試劑盒合成相應(yīng)的cDNA。采用熒光染料SYBR?Green 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和突變實(shí)驗(yàn)如前報(bào)道［15］，以HCT?116 細(xì)胞cDNA 為模板，用PCR 方法擴(kuò)增目的基因mRNA 的3'?UTR 序列，將其克隆到雙熒光素酶載體pmiGLO 中，同時(shí)再利用美國(guó)安捷公司的Quick ChangeⅡ定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)3'?UTR序列中的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別構(gòu)建位點(diǎn)1、位點(diǎn)2 以及位點(diǎn)1 和2 共突變載體，同時(shí)用miRNA 模擬物、miRNA 拮抗劑和對(duì)照再次進(jìn)行分組。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性，表達(dá)效率用均一化后的螢火蟲熒光素酶信號(hào)和海腎素?zé)晒馑孛感盘?hào)來反應(yīng)。

1.2.6 基因表達(dá)載體的構(gòu)建和感染靶基因的穩(wěn)定敲減由慢病毒介導(dǎo)的HIF?1α?shRNA 來執(zhí)行，而靶基因的沉默和過表達(dá)則由pCDH?puro 慢病毒載體實(shí)現(xiàn)。在相應(yīng)病毒載體構(gòu)建完成后，將符合要求的病毒載體在8 mg/mL 溴化己二甲胺的介導(dǎo)下感染靶細(xì)胞。最后用1 μg/mL 嘌呤霉素篩選出對(duì)應(yīng)的獲得穩(wěn)定敲減、敲除、沉默或過表達(dá)的細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多組定量數(shù)據(jù)采用方差分析，當(dāng)P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)分析結(jié)果及驗(yàn)證GEO 芯片數(shù)據(jù)（GSE?77606）及KEGG 通路富集分析顯示低氧環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞的代謝通路異常（P= 0.036），F(xiàn)UT4 表達(dá)下調(diào)（圖1A、B）。QRT?PCR 證實(shí)FUT4 在低氧培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT?116 和HT?29 中低表達(dá)，其在HCT?116 中表達(dá)明顯降低（P< 0.001）（圖1D），而TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)資料顯示原始結(jié)腸癌標(biāo)本中FUT4 基因表達(dá)升高（P<0.05）（圖1C）。

圖1 數(shù)據(jù)分析及驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Bioinformatics analysis of colon cancer cells under hypoxia and validation of FUT4 expression

2.2 miRNA 篩選結(jié)果在TargetScan 等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到與FUT4基因mRNA3'?UTR 互補(bǔ)的miRNA為hsa?miRNA?23a?3p，且該miRNA 與FUT4mRNA存在兩個(gè)靶向作用位點(diǎn)，分別為位點(diǎn)1（第781?788位堿基）和位點(diǎn)2（第867?873 位堿基）。見圖2。

2.3 相關(guān)基因引物及干擾RNA 序列設(shè)計(jì)通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NICB）基因庫(kù)查找到相應(yīng)基因序列。根據(jù)引物及干擾RNA 序列設(shè)計(jì)基本原則，確定了相關(guān)基因引物序列及HIF?1α?shRNA干擾序列。見表1。

圖2 FUT4（mRNA）?hsa?miRNA?23a?3p 匹配結(jié)果Fig.2 Complementary matching analysis of hsa?miRNA?23a?3p in the 3'UTR of FUT4

表1 引物序列及干擾RNA 序列Tab.1 Real?time PCR primer sequences and shRNA sequence

2.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果及hsa?miRNA?23a?3p表達(dá)驗(yàn)證熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和突變實(shí)驗(yàn)顯示熒光強(qiáng)度除了與hsa?miRNA?23a?3p的濃度有關(guān)外，還與作用位點(diǎn)有關(guān)，證實(shí)hsa?miRNA?23a?3p 可通過靶向位點(diǎn)1 和位點(diǎn)2，促進(jìn)FUT4mRNA 的降解，其中位點(diǎn)1 在FUT4?hsa?miRNA?23a?3p 的相互作用中起主要介導(dǎo)作用（圖3A）。同時(shí)證實(shí)了低氧環(huán)境可誘導(dǎo)hsa?miRNA?23a?3p的表達(dá)（圖3B）

2.5 HIF?1αsh RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果HIF?1αsh RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示，正常氧環(huán)境下，HCT?116 細(xì)胞中HIF?1α的表達(dá)與hsa?miRNA?23a?3p的表達(dá)無明顯相關(guān)性，但在低氧環(huán)境下，與無義干擾相比，用特異性的shRNA 對(duì)HIF?1α進(jìn)行干擾后，hsa?miRNA?23a?3p的表達(dá)明顯下調(diào)（圖5，P< 0.05）。上述實(shí)驗(yàn)說明HIF?1α可作為轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控miRNA?23a?3p 的表達(dá)。

2.6 FUT4?hsa?miRNA?23a?3p相關(guān)性驗(yàn)證hsa?miRNA?23a?3p過表達(dá)和沉默實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)在HCT?116細(xì)胞系中導(dǎo)入反義表達(dá)miR?23a的質(zhì)粒miRZip?23a時(shí)，F(xiàn)UT4基因的表達(dá)明顯升高，相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的質(zhì)粒為miR?23a?3p過表達(dá)載體時(shí)，F(xiàn)UT4基因的表達(dá)明顯下調(diào)，即hsa?miRNA?23a?3p 可調(diào)控FUT4mRNA 的表達(dá)水平（圖5，P<0.05）。

圖3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果及hsa?miRNA?23a?3p 表達(dá)驗(yàn)證Fig.3 Results of luciferase activity assay and measurement of hsa?miRNA?23a?3p expression

圖4 HIF?1αshRNA 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of HIF?1α knockdown assay

圖5 QRT?PCR 檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件下FUT4 的表達(dá)情況Fig.5 Measurement of FUT4 expression under hypoxia by QRT?PCR

3 討論

結(jié)腸癌作為胃腸道中最常見的惡性腫瘤之一，近20年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，目前結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率分別排在胃腸道腫瘤的第一位和第二位［16］。同時(shí)結(jié)腸癌作為一類實(shí)體腫瘤，在其快速增長(zhǎng)的過程中往往也會(huì)因?yàn)樾律苌L(zhǎng)滯后和通行性差而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)的形成，因此對(duì)結(jié)腸癌在低氧狀態(tài)下的病理生理機(jī)制探索具有重要的預(yù)防和治療意義。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞可通過HIF?1α/hsa?miRNA?23a?3p/FUT4軸下調(diào)FUT4的表達(dá)。

如前所述，HIF?1α作為缺氧反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子和調(diào)節(jié)因子，它可以與位于靶基因5'或3'區(qū)的缺氧反應(yīng)原件的增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，主要促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展，但有時(shí)也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。其中缺氧反應(yīng)元件主要包括血紅素氧合酶-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、糖酵解酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1/4 和一些腫瘤特異性表達(dá)基因或非編碼RNA［17］。miRNA 是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，雖不直接翻譯蛋白參與細(xì)胞的生命代謝活動(dòng)，但可在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，每個(gè)miR?NA 可以有多個(gè)靶基因，而不同的miRNA 也可靶向同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA 來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可通過幾個(gè)miRNA 的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。研究顯示，miRNAs 在惡性腫瘤的發(fā)展過程中既可作為腫瘤促進(jìn)因子又可作為腫瘤抑制因子。但針對(duì)miRNA?23a?3p 在結(jié)直腸癌中的研究少有報(bào)道。

FUT4屬于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase，F(xiàn)UT）家族，是一類具有重要生化作用的糖基轉(zhuǎn)移酶。該家族目前共13 個(gè)成員，主要負(fù)責(zé)催化從核苷二磷酸巖藻糖中將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到受體分子上，其中受體分子主要為糖蛋白或糖脂分子上的寡糖鏈［18］，但有時(shí)也可直接將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到多肽鏈上［19］。存在于細(xì)胞表面且被巖藻糖基化的寡糖包括Lewis A（Le（a））、Lewis B（Le（b））、Lewis X（Le（x））（CD15 抗原）、Lewis Y（Le（y））等路易斯寡糖和sialylLewis A（sLe（a））、sialylLewis X（sLe（x））等被唾液酸化的路易斯寡糖，其中FUT4主要負(fù)責(zé)合成Le（x）/CD15 和Le（y）。這些寡糖鏈?zhǔn)羌?xì)胞表面糖蛋白和糖脂發(fā)揮其生理功能的重要組成部分之一，可參與細(xì)胞識(shí)別與黏附、胚胎著床與發(fā)育、白細(xì)胞遷移等炎癥反應(yīng)以及腫瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)展和免疫逃逸等生理過程［20］。

目前的研究顯示，F(xiàn)UT4及其修飾的巖藻糖基化糖蛋白抗原（以Le（x）/CD15 為主）的過表達(dá)與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和化療抵抗有關(guān)［21］，這與本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的分析結(jié)果一致（圖1C）。GIORDANO 等［22］的研究表明，約43%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中CD15/FUT4呈高表達(dá)狀態(tài)，且與低表達(dá)者相比，CD15/FUT4高表達(dá)的患者腫瘤內(nèi)部CD3+和CD8+T 細(xì)胞比例下降，且對(duì)西妥昔單抗和貝伐珠單抗等靶向藥物的原發(fā)耐藥率明顯更高，預(yù)后也更差，這意味著FUT4可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃逸。另一項(xiàng)研究指出［23］，在正常氧濃度培養(yǎng)的SW620和SW480細(xì)胞系中加入可靶向FUT4mRNA的miR?26a/26b 模擬物可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)。而在其他腫瘤的相關(guān)研究中同樣證實(shí)，F(xiàn)UT4可參與乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以促進(jìn)細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)［24］，miR?493?5p 則可通過靶向FUT4mRNA降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲性和致瘤性［25］。而miR?NA?125a?5p 可以通過靶向FUT4mRNA 進(jìn)而抑制膀胱癌的進(jìn)展［26］。

但在本研究中，結(jié)腸癌細(xì)胞可以通過HIF?1α/hsa?miRNA?23a?3p/FUT4軸下調(diào)FUT4的表達(dá)，這可以理解為是HIF 對(duì)腫瘤的又一個(gè)負(fù)調(diào)控機(jī)制。HIF 和FUT4目前被公認(rèn)為是惡性腫瘤侵襲性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移主要的促進(jìn)因素。但有趣的是，本研究證實(shí)了這兩大因素之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。雖然在原始結(jié)腸癌標(biāo)本中，F(xiàn)UT4的表達(dá)是上調(diào)的，但可以肯定的是，這種表達(dá)差異并不是由HIF 所誘導(dǎo)的，或許還有其他拮抗HIF 誘導(dǎo)FUT4表達(dá)下調(diào)的機(jī)制值得進(jìn)一步探索。