魯斌 程敏 周凡

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院肝膽外科（安徽巢湖238000）；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院（南昌330006）

肝癌是一種高發(fā)惡性腫瘤，全世界每年新增肝癌患者約60 萬例，全球超過50%的肝癌新發(fā)病例在我國［1］。晚期轉(zhuǎn)移性肝癌預(yù)后差，無治愈可能，中位生存期不足12個月［2］。細(xì)胞凋亡與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而如何有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡成為近年來肝癌研究熱點(diǎn)，例如組織工程技術(shù)［3］。Bad 和Caspase?8 是促細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白，能 正反饋調(diào)控細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［4-5］。本研究擬利用基因重組技術(shù)構(gòu)建Bad?Caspase?8 共表達(dá)基因，評估Bad 和Caspase?8 蛋白過表達(dá)對SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和體內(nèi)移植成瘤效果影響，探究其作為肝癌治療靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑人SK?HEP?1 人肝癌細(xì)胞系購自南京科佰生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗試劑均購自美國Gibco 公司，細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自美國Thermo Scientific 公司，CCK?8 檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，Annexin V?FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；鼠抗人單克隆Bad 抗體、鼠抗人單克隆Caspase?8抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG 二抗均購自美國CST 公司，兔抗鼠β?actin 單克隆抗體購于美國Santa Cruz 公司。通用型蛋白電泳儀（164?5070）采用美國Bio?Rad 公司產(chǎn)品。本研究委托上海吉凱基因公司設(shè)計(jì)合成Bad?Caspase?8 融合基因及轉(zhuǎn)染用慢病毒。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批件號：2016HZ0031。

1.2 Bad?Caspase?8融合基因構(gòu)建及慢病毒包裝pubmed 基因數(shù)據(jù)庫查詢Bad 和Caspase?8 基因信息，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成Bad?Caspase?8 融合基因序列，PCR 擴(kuò)增，靶向克隆至慢病毒GV238 載體中，上游引物序列：5'?CGACAAAAGCAAATGCGACAC?3'，下游引物序列：5'?CCTATTATTTCCACGTAGTCTC?3'，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35 次。取適量菌液，進(jìn)行基因測序，比對分析目的基因序列，抽提質(zhì)粒，包裝過程由自失活型慢病毒包裝系統(tǒng)完成，將Bad?Caspase?8 融合基因載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染239T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，高速離心，收集含Bad?Caspase?8 融合基因慢病毒顆粒的239T細(xì)胞上清液，-80 ℃保存。

1.3 細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞5×105個/mL 種植6 孔板中，每孔2 mL。吉凱基因公司推薦的SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為75?100，實(shí)驗(yàn)組：5 μg/mL Polybrene+50 μL Bad?Caspase?8 融合基因重組病毒上清液，對照組：5 μg/mL Polybrene+50 μL 陰性對照病毒上清液，空白組：相同體積細(xì)胞培養(yǎng)液。本慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中含有GFP 基因，可利用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞儀檢測基因轉(zhuǎn)染效率。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測定樣品中總蛋白濃度，上樣量40 μg，110 v 電泳，300 mA 電壓濕轉(zhuǎn)2 h，5%脫脂奶粉室溫（25 ℃）封閉2 h，剪膜，加入Bad 抗體（一抗）和Caspase?8 抗體（一抗），1∶500 洗膜緩沖液稀釋，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠二抗，1∶1 000 洗膜緩沖液稀釋，室溫孵育2 h，1∶3 000 稀釋β?Actin 蛋白作為內(nèi)參，顯色定影，雜交條帶分析。

1.5 CCK?8 檢測細(xì)胞增殖情況轉(zhuǎn)染后72 h，在96 孔板中接種100 μL 細(xì)胞懸液，每組6 孔，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h，每孔加入10 μL CCK?8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，酶標(biāo)儀測定吸光度（450 nm），每孔復(fù)測3 次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況胰酶消化，離心，每管收集2×105個細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer。加入10 μL Annexin V?FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min。加入300 μL Binding Buffer，上機(jī)測定各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，Transwell上室中加入100 μL 各組細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×105個/L，下室加入600 μL細(xì)胞培養(yǎng)液。Transwell小室孔徑8 μm，24 h 后，取出Transwell 小室，PBS清洗2 次，然后用95%乙醇固定15 min。PBS 清洗2 次，結(jié)晶紫染色30 min，PBS 清洗2 次，用棉簽擦去上室表面附著細(xì)胞，倒置顯微鏡下隨機(jī)取左、右、上、下、中心5 個視野，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組平均數(shù)。

1.8 評估體內(nèi)移植成瘤效果轉(zhuǎn)染72 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 離心，1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 × 108個/mL，注射于裸鼠背部皮下，按照細(xì)胞處理分組，每組4 只，每只注射0.2 mL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞總數(shù)約2 × 107個，每3 天卡尺測量瘤塊長徑（a）和短徑（b），單位cm，腫瘤體積=0.5×a×b2，接種15 d 處死裸鼠，完整取出腫瘤對比分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素多樣本方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較，采用t檢驗(yàn)分析進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率慢病毒轉(zhuǎn)染SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞效率達(dá)到87.7%，熒光顯微鏡下觀察到滿視野綠色熒光（GFP）分布，這種高轉(zhuǎn)染效率為其后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖1 體外慢病毒轉(zhuǎn)染SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞效率Fig.1 SK?HEP?1 hepatoma cells were transfected by lentivirus in vitro

2.2 Bad和Caspase?8蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染72 h后，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測，實(shí)驗(yàn)組Bad 和Caspase?8蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組和空白組（圖2）。

圖2 各組Bad 和Caspase?8 蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of Bad and Caspase?8 protein in each group

2.3 細(xì)胞增殖活性變化細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，與對照組和空白組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯降低，實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組OD值分別為0.86 ±0.122、1.89±0.315 和2.01±0.194，（F=40.314，P<0.001，圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性Fig.3 Cell proliferation after transfection

2.4 細(xì)胞凋亡情況轉(zhuǎn)染72 h 后，與對照組和空白組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯增加，實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為（31.6±2.8）%、（3.2 ± 0.9）%和（2.9 ± 1.1）%，（F= 248.023，P<0.001），對照組和空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（t=0.366，P=0.733，圖4）。

圖4 細(xì)胞凋亡率測定Fig.4 The measurement of cell apoptosis

2.5 細(xì)胞遷移情況轉(zhuǎn)染72 h 后，與對照組和空白組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯降低，實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組細(xì)胞遷移數(shù)分別為18 ± 3，77±10 和85±11，（F=85.833，P<0.001，圖5）。

圖5 各組細(xì)胞遷移情況Fig.5 Cell migration in each group（×）

2.6 體內(nèi)成瘤效果裸鼠皮下注射后，對照組和空白組裸鼠移植瘤注射生長迅速，6 d 后呈現(xiàn)指數(shù)曲線快速生長，到第15 天平均腫瘤體積分別達(dá)到（4.4 ± 0.29）cm3和（4.9 ± 0.42）cm3，而實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤生長較緩慢，到第15 天平均腫瘤體積僅為（1.6±0.17）cm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F=133.443，P<0.001，圖6）。

圖6 體內(nèi)移植瘤生長曲線分析Fig.6 Growth curve analysis of the transplanted tumor in vivo

3 討論

細(xì)胞凋亡由內(nèi)外源因素觸發(fā)死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程［6］。細(xì)胞凋亡異常與腫瘤起源、進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，凋亡抑制或減弱是多種癌癥的共同表現(xiàn)，誘導(dǎo)凋亡是目前靶向治療的主要策略之一。研究［7］證實(shí)，肝癌細(xì)胞凋亡與淋巴轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級和臨床分期均存在顯著相關(guān)性，因此直接干預(yù)腫瘤細(xì)胞凋亡有望成為肝癌治療新手段。

Caspase 家族是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，通過級聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase?8 蛋白是細(xì)胞凋亡死亡受體途徑的終末剪切酶，通過與死亡配體相似的Caspase 途徑和線粒體依賴途徑激活Caspase?3，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。同時，活性Caspase?8 可作用于其他Caspase 成員和凋亡相關(guān)死亡受體信號通路，并降解相應(yīng)的胞漿胞核底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。Caspase 蛋白表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖活性呈顯著負(fù)相關(guān)［10］。如果Caspase?8 活性異?；虻拖拢瑒t出現(xiàn)細(xì)胞凋亡異常，從而誘發(fā)腫瘤。Bad 蛋白屬于bcl?2基因家族，Bad 活化后可直接穿透線粒體外膜，加速細(xì)胞死亡［11］。Bad 蛋白在肝癌組織中低表達(dá)而在正常肝組織中表達(dá)明顯增加，Bad 蛋白水平與肝癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)［12］。

在本研究中，筆者利用基因重組技術(shù)構(gòu)建Bad?Caspase?8 靶向共表達(dá)融合基因，通過慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并隨機(jī)整合到宿主基因組中，使其持續(xù)表達(dá)Caspase?8 和Bad 蛋白。SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞株是肝癌研究常用種子細(xì)胞，其貼壁生長，細(xì)胞活性好，容易轉(zhuǎn)染。本研究GV238 慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80.6%，甚至高于國外學(xué)者HORIBE 等［13］報(bào)道的同類型轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染72 h 后，實(shí)驗(yàn)組Bad和Caspase?8 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，這表明融合基因整合至細(xì)胞基因組并成功轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。其次，Bad 和Caspase?8 蛋白過表達(dá)顯著降低SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞增殖活性，明顯增加細(xì)胞凋亡，這表明Bad 和Caspase?8 蛋白過表達(dá)對于SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞生長活性起著負(fù)性調(diào)控作用。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移往往是腫瘤治療失敗的主要原因，也是晚期腫瘤患者預(yù)后不良的主要因素［14］。過去國內(nèi)外學(xué)者致力于miRNA 技術(shù)調(diào)節(jié)wnt 信號通路抑制轉(zhuǎn)移發(fā)生，但是miRNA 隨著時間延長而降解失效，且容易出現(xiàn)干擾和誤差［15］。Bad和Caspase?8 基因作為其蛋白表達(dá)上游調(diào)控因素，直接作用于基因表達(dá)，增加下游促凋亡蛋白合成，顯著促進(jìn)細(xì)胞死亡［16］。同時，細(xì)胞凋亡涉及到腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的多個關(guān)鍵步驟，包括瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤、逃避免疫細(xì)胞殺傷及在遠(yuǎn)隔臟器定植等［17］。通過增加腫瘤細(xì)胞凋亡，可同時抑制其轉(zhuǎn)移行為，誘導(dǎo)癌細(xì)胞處于長期靜止和休眠狀態(tài)，有可能實(shí)現(xiàn)長期帶瘤生存［18-19］。本研究觀察Bad 和Caspase?8 蛋白過表達(dá)后，導(dǎo)致SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞遷移數(shù)降低，提供一種抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新思路。最后，對照組和空白組腫瘤生長迅速，而實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積注射后雖有所增加，但呈現(xiàn)腫瘤抑制生長狀態(tài)，從而有效驗(yàn)證了本研究預(yù)想。本研究存在一定局限性，首先Bad 和Caspase?8 蛋白表達(dá)受多種基因和調(diào)控蛋白影響，可能出現(xiàn)基因和蛋白表達(dá)不一致情況；其次，不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能在不同的細(xì)胞類型和器官中產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)［20］，本研究只采用SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞株作為研究對象，存在選擇偏倚，是否在人體內(nèi)Bad 和Caspase?8 蛋白過表達(dá)也能很好發(fā)揮抗肝癌作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建Bad?Caspase?8融合基因，可明顯增強(qiáng)促凋亡因子Bad 和Caspase?8 蛋白表達(dá)，顯著降低SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞凋亡，減少SK?HEP?1肝癌細(xì)胞遷移，抑制SK?HEP?1 肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤效率，可作為肝癌靶向治療潛在靶點(diǎn)。