董松果,李浩,李東方,張勝利

（1.河南科技學院生命科技學院,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南省糧食作物基因組編輯工程技術中心,河南新鄉(xiāng)453003；3.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003）

小麥籽粒中的粗蛋白含量是小麥品質(zhì)類型劃分的重要依據(jù)之一,小麥品質(zhì)的優(yōu)劣在很大程度上影響其經(jīng)濟價值[1].小麥種子的蛋白質(zhì)約85%～90%是儲藏蛋白,主要分布于胚乳中.小麥面粉主要來自于小麥種子的胚乳,其蛋白質(zhì)含量是小麥營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)的重要指標之一[2].目前,小麥蛋白含量測定有化學法和物理法,前者大多用常規(guī)的消煮+凱氏定氮法或者消煮+連續(xù)流動分析儀法[3-4],這些方法都具有較高的準確度,但是需要對試驗材料進行消煮等繁雜的化學處理,比較耗時費力,同時試驗中強酸、強堿的使用會造成一定的環(huán)境污染；后者常用的是近紅外光譜法[5].作為一種無損、快速、高效的現(xiàn)代分析技術,近紅外光譜技術（near infrared spectrum,NIRS）綜合運用了光譜、計算機和化學計量學等多個學科的最新研究成果,在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療健康等多個領域得到了越來越廣泛的應用[6-9].美國谷物化學協(xié)會最早將近紅外光譜技術應用在小麥品質(zhì)檢測中,用來測定小麥蛋白質(zhì)含量和水分含量.隨著光譜技術、計算機技術等的進步,近紅外光譜檢測技術也在不斷發(fā)展,檢測準確度和精度不斷提高.瑞典波通公司生產(chǎn)的DA7250 型近紅外測定儀是該公司推出的第三代二極管陣列近紅外分析儀, 在前兩代基礎上進一步完善了相關軟硬件,具有更快、更準、更穩(wěn)定的特點.DA7250 采用固定全息光柵分光,銦鎵砷二極管陣列技術,連續(xù)光柵光譜檢測,并行處理所有波長信息,可檢測水分、蛋白、脂肪、淀粉、纖維、灰分、氨基酸等參數(shù).隨著人們生活水平地不斷提高,生產(chǎn)上對優(yōu)質(zhì)強筋小麥的需求日益增加.這對當前小麥生產(chǎn)上優(yōu)質(zhì)強筋品種的快速培育提出了更高的要求.

本研究以33 個小麥品種為材料,進行不同小麥品種蛋白質(zhì)含量的常規(guī)化學測定方法和近紅外光譜快速測定方法的比較分析,以期為小麥新品種培育中品質(zhì)分析方法選擇提供一定參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 小麥品種共計33 個（西農(nóng)979、豐德存麥1 號、新麥26、陜253、小偃22、鄭麥379、高優(yōu)503、魯麥21、山農(nóng)12 號、濟麥21 號、川麥36、小偃54、京冬22、中優(yōu)9507、煙農(nóng)15、溫麥6 號、豫麥34、矮抗58、洛麥23、偃展4110、綿麥48、濟麥22 號、石家莊8 號、新麥9 號、揚麥16、濟麥19 號、皖麥19、京411、揚麥158、京冬8、漯麥18、輪選66、新麥35）,其中優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種17 個,中筋品種16 個.試驗材料種植于河南、陜西兩個生態(tài)點,其中河南為兩年數(shù)據(jù).

1.1.2 儀器試劑 近紅外測定儀為瑞典波通公司生產(chǎn)的DA7250 型；磨粉機為杭州大成光電公司生產(chǎn)的JMFD70×30 型；常規(guī)化學法測定所用儀器主要是德國Bran Luebbe 公司生產(chǎn)的AA3 型連續(xù)流動分析儀.化學試劑如硫酸、H2O2、NaOH、酒石酸鈉、水楊酸鈉、硝普鈉等均為分析純.

1.2 試驗方法

1.2.1 近紅外法 近紅外法在小麥各品質(zhì)參數(shù)的測定上應用較早[5],近紅外測定儀更新?lián)Q代也比較快,測定的準確度也在不斷提高.本研究采用波通公司推出的第三代近紅外光譜測定儀（DA7250 型）進行蛋白質(zhì)含量測定.DA7250 型近紅外測定儀測定小麥整粒種子的具體操作方法為：開機完成自檢后點擊“分析”按鈕,再選擇要分析的產(chǎn)品“wheat”,接著將小麥籽粒樣品倒入樣品盤,輕震使籽粒填滿樣品盤,用透明直尺將超過樣品盤的部分刮出來,最后將樣品盤放置在DA7250 的磁力盤上,點擊“分析“按鈕開始分析.樣品ID 可以自動添加或用戶手動添加.只需要數(shù)秒鐘即可完成一個樣品的分析,相關數(shù)據(jù)會自動保存?zhèn)溆?

1.2.2 常規(guī)化學法

（1）樣品的準備與消解.待測小麥樣品用近紅外儀測定后用同一個磨粉機進行制粉,該磨粉機配備的網(wǎng)篩孔徑為250 μm（約為60 目）,所制面粉樣品符合GB/T 5506、GB/T 2057 等相關要求.將待測小麥面粉樣品在烘箱中105 ℃烘干3 h,采用凱氏法處理面粉-硫酸與雙氧水消解.秤取待測樣品0.100 0±0.001 0 g,加入5 mL 硫酸進行消解,然后用去離子水定容至100 mL.每個樣品設置一組3 個重復,每6 個樣品設置一組空白試驗,即不添加面粉樣品,只加入5 mL 硫酸相同方法消解后定容至100 mL,搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管備測.

（2）AA3 型流動分析儀試劑配制.采用AA3 型連續(xù)流動分析儀進行消解后樣品的N 含量測定,再根據(jù)小麥中的換算系數(shù),折算成蛋白質(zhì)含量.所需要配制的相關藥品及方法分別為：

緩沖溶液：35.8 g Na2HPO4·12H2O,44.5 g NaOH,50 g 酒石酸鈉,溶于去離子水中,定容至1 000 mL；

水楊酸：稱取40 g 水楊酸鈉,1 g 硝普鈉（Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O）,溶入去離子水并定容至1 000 mL；

NaClO：量取質(zhì)量分數(shù)為5.25%的NaClO 溶液3 mL 定容至100 mL；

樣品清洗液：量取硫酸40 mL 使用去離子水定容至1 000 mL.

（3）AA3 型流動分析儀測定.標準溶液的制備：用100 mL 容量瓶將質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的銨態(tài)氮標準溶液與樣品同等酸度硫酸溶液混合,配制質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、20 和30 mg/L 的標準溶液.在測定前用流動分析儀測得標準曲線,以此為標準由吸光度值獲得相應的質(zhì)量濃度.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 主要采用Microsoft Excel 2010 進行相關數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關性分析

不同筋度小麥品種的兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關性見表1.

表1 不同筋度小麥品種的兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關性Tab.1 Correlation between two methods for determination of protein content in wheat cultivars with different gluten levels

由表1 可知,不論生態(tài)間還是年際間,常規(guī)化學法和近紅外法兩者測定結(jié)果總體上看都是極顯著相關；但根據(jù)品質(zhì)指標分成不同筋度類型后進行相關分析,發(fā)現(xiàn)主要是強筋品種的相關性在年際間、生態(tài)間都極顯著.這暗示在強筋小麥品種蛋白質(zhì)含量檢測上兩種方法檢測結(jié)果變化趨勢相同,即不同生態(tài)地區(qū)進行強筋小麥育種時,可以用近紅外檢測法對后代群體的蛋白質(zhì)含量進行快速無損檢測,能夠節(jié)省大量人力、物力,有助于加快強筋小麥育種進程,滿足生產(chǎn)上人們消費水平的提高對小麥高品質(zhì)品種的需求.而中筋小麥由于兩者相關性不穩(wěn)定,育種上應用近紅外檢測雜交后代的蛋白質(zhì)含量時僅供參考,需要在后續(xù)種子量較大的世代進行化學法精確測定.

2.2 不同小麥品種兩種測定方法蛋白質(zhì)含量的相關性回歸方程

不同生態(tài)點、不同筋度類型小麥品種兩種測定方法所得蛋白質(zhì)含量的相關性回歸方程見圖1、圖2.

圖1 陜西生態(tài)點不同筋度小麥品種的兩種測定方法所得蛋白質(zhì)含量的相關性Fig.1 The correlation between the two methods for protein content assayamong differentwheat cultivars with different gluten qualitygrown inShaanxi province

圖2 河南生態(tài)點不同筋度小麥品種的兩種測定方法所得蛋白質(zhì)含量的相關性Fig.2 The correlation between the two methods for protein content assayamong differentwheat cultivars with different gluten qualitygrown in Henan province

由圖1 和圖2 可知,不同生態(tài)點、不同年度均表現(xiàn)為近紅外法測定結(jié)果高于化學法,強筋小麥化學法測定蛋白質(zhì)含量平均值為11.07%,近紅外法為15.18%,這與兩種方法測定樣品狀態(tài)不同有關,化學法所測為面粉樣品,近紅外法所測為整粒種子.按照面粉蛋白占整粒種子蛋白的85%計算,推導出的強筋小麥平均種子蛋白含量約為13.02%（11.07/0.85）,比近紅外法測定結(jié)果的平均值低了約2 個百分點,這與李冬梅等[10]的研究結(jié)果比較接近.本研究發(fā)現(xiàn),強筋小麥品種的兩種測定方法雖然所測樣品狀態(tài)不同,但其相關性不管是年際間還是生態(tài)間都是極顯著的,這為育種領域、糧食收儲或加工領域的實際應用提供了一定的參考.本研究不同生態(tài)點、不同年度所有強筋小麥品種兩種測定方法的相關性回歸方程為：y=0.607 3x+8.452 5（其中x 為化學法所測值,y 為近紅外法所測值,R2=0.606 2,r=0.778 6**）,所以可以根據(jù)該方程方便地計算出近紅外法測定結(jié)果所對應的化學法預測值.經(jīng)本研究所得數(shù)據(jù)測算,預測值與化學法實測值的差值占后者的比例為10.55%,也就是預測值的準確度大約為90%.對于中筋品種來說,不同生態(tài)點、不同年度總體來看,化學法測定蛋白質(zhì)含量平均值為9.73%,近紅外法為14.13%,兩者差值與強筋小麥接近,但由于中筋小麥相對于強筋小麥來說不同生態(tài)點、不同年度兩種測定方法的相關性均較差,因此在蛋白含量測定上,無損、快速檢測的近紅外法對中筋小麥品種參考價值一般.

3 結(jié)論與討論

近紅外光譜測定法作為一種無損、快速、高效的現(xiàn)代分析技術目前已經(jīng)在包括農(nóng)業(yè)在內(nèi)的許多重要行業(yè)中有著廣泛的應用[10-12].李冬梅等[13]研究認為8620、DA7200 兩種型號的近紅外儀在小麥面粉蛋白含量測定上都與傳統(tǒng)的凱氏定氮法存在顯著相關,可以應用這些近紅外儀對小麥面粉蛋白質(zhì)進行測定,并認為在F2 代性狀分離的大量后代群體中可以運用DA7200 型近紅外儀對個體的少量粉樣測定進行早期預測.該研究沒有根據(jù)不同小麥品種的品質(zhì)差異進行分類分析.本研究發(fā)現(xiàn),總體上兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關分析所得結(jié)論與李冬梅等的結(jié)果是一致的,但進行不同筋度分類分析后發(fā)現(xiàn),不同生態(tài)地區(qū)常規(guī)化學法和近紅外法的相關性上,均是強筋小麥中極顯著相關,而在中筋小麥中相關性不穩(wěn)定.這暗示強筋小麥的蛋白質(zhì)含量主要是受基因型控制,受環(huán)境影響較小,而中筋小麥在蛋白質(zhì)含量上受環(huán)境影響較強筋小麥大[14].這與魏益民等[15]的研究結(jié)果基本一致.魏益民等對陜西省關中小麥品種區(qū)域試驗的12 個小麥品種（品系）在12 個試點的數(shù)據(jù)資料進行了相關分析,發(fā)現(xiàn)基因型與環(huán)境互作、環(huán)境效應都對蛋白質(zhì)含量影響較小,而基因型效應對包括蛋白質(zhì)含量在內(nèi)的所有品質(zhì)參數(shù)均有顯著影響.

隨著光譜技術、化學計量技術、計算機技術等快速發(fā)展,近紅外光譜測定儀也在不斷進行更新?lián)Q代.本研究采用波通公司推出的第三代近紅外光譜測定儀——DA7250 型,對近紅外光譜儀在不同小麥品種蛋白質(zhì)含量快速、無損的檢測進行了效果評價.研究結(jié)果證實,不同生態(tài)地區(qū)進行強筋小麥育種時可以用近紅外檢測法對雜交后代群體的蛋白質(zhì)含量進行快速、無損檢測,對小麥新品種培育,尤其是優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種培育中品質(zhì)分析方法選擇具有一定參考價值.