李 嵐 段 綱 楊春艷 李曉成

1.廣西壯族自治區(qū)畜牧站，南寧530022；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明650201；3.云南省楚雄州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，云南楚雄675000；4.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種以嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和食欲下降等為主要特征的急性、高度接觸性豬腸道傳染病[1]。2010年末，我國大面積暴發(fā)以新生仔豬嚴重腹瀉、高發(fā)病率及高死亡率為主要特征的腹瀉疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。近年來，其流行情況越來越復(fù)雜，發(fā)病率和死亡率依然居高不下[3]。PEDV 基因組為線形不分節(jié)段的單股正鏈RNA，核酸具有侵染性。PEDV 的S 結(jié)構(gòu)蛋白在免疫介導(dǎo)中具有非常重要的作用，它的C 端擁有5 個疏水殘基鏈，在此處有可能形成α 螺旋，起到膜受體的作用，其S1 區(qū)被推斷在腸嗜性表達中起一定作用，并含有主要中和作用的抗原決定簇。此外，S 蛋白還具有識別靶細胞、促進細胞和細胞膜的融合等作用。分析PEDV 流行株S基因，可反映流行毒株的遺傳變異情況，為疫苗株的選擇和PEDV 的防治提供依據(jù)。試驗擴增了我國6 省市的19 個PEDV 流行毒株S基因，并對其進行了序列測定與分析，以探究我國PEDV 的遺傳變異規(guī)律，豐富我國PEDV的分子流行病學(xué)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品

采集自6 省份13 個疑似PEDV 發(fā)病豬場的7日齡內(nèi)仔豬小腸及其內(nèi)容物樣品，共19 份。樣品編號、采樣地區(qū)詳見表1。

表1 19 個PEDV 樣品

1.2 主要試驗材料

TRIzol LS R Reagent RNA 提取試劑盒購自美國Invitrogen 公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit、EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-preps kit、感受態(tài)大腸桿菌Escherichia coliDH5α 均購自寶生物工程（大連）有限公司；Wizard SV Geland PCR Clean-Up System 購自Promega 公司；pGEM-T easy載體購自Promega 公司；Agarose 瓊脂糖購自上海TiYo 公司；GelRed 核酸凝膠染料購自美國BIOTIUM 公司。

1.3 引物設(shè)計

參照GenBank 上發(fā)表的PEDV BJ 2011-1（登錄號：JN825712.1）的基因序列，應(yīng)用Primer5.0 軟件設(shè)計了針對PEDVS基因的3 對引物（引物序列詳見表2），由上海生工生物工程有限公司進行引物的合成。

表2 PEDVS 基因組擴增引物

1.4 樣品處理

采取無菌操作，小腸及其內(nèi)容物用已含1 000 U/mL 青霉素、鏈霉素的DMEM 進行5 倍稀釋后制成懸液，將制成的懸濁液分裝到無菌離心管中，樣品在-80 ℃和37 ℃之間反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒RNA 的提取

按TRIZOL LS R Reagent RNA 提取操作說明書提取病毒基因組總RNA，用20 μL DEPC 處理水溶解，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 S 基因的擴增與克隆

按PrimeScript One Step RT-PCR Kit 操作說明，以RNA 為模板，S1-F/S1-R、S2-F/S2-R、S3-F/S3-R 分別為引物進行一步法RT-PCR。RT-PCR 反應(yīng)體系：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，上下游引物各1 μL，RNA 模板3 μL，滅菌蒸餾水18 μL。引物S1-F/S1-R 的反應(yīng)條件為：50 ℃30 min；95 ℃5 min；95 ℃60 s、55 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物S2-F/S2-R 的反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；95 ℃40 s、55 ℃40 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。引物S3-F/S3-R 的反應(yīng)條件為：50 ℃30 min；95 ℃5 min；95 ℃60 s、55 ℃ 90 s，72 ℃ 5 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取出PCR 產(chǎn)物5 μL 擴增產(chǎn)物，加1 μL 6×Loading Buffer ，10 g/L 瓊脂糖凝膠、120 V 電壓45 min，電泳檢測，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增片段并統(tǒng)計結(jié)果。

1.7 產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化

按Promega 公司的Wizard SV Geland PCR Clean-Up System 試劑盒說明書進行PCR 產(chǎn)物回收，將回收純化的PCR 產(chǎn)物與pGEM-T easy 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，再參照質(zhì)粒提取試劑盒EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-preps kit說明書提取重組質(zhì)粒DNA。提取的重組質(zhì)粒在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，根據(jù)質(zhì)粒DNA 條帶的大小，挑選出疑似的陽性重組質(zhì)粒，用PCR 進行鑒定，再取5 μL PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行結(jié)果統(tǒng)計分析。將鑒定后的重組質(zhì)粒送寶生物工程有限公司進行測序，試驗中有部分基因片段直接送PCR 產(chǎn)物進行測序。

1.8 序列比對與分析

將測序結(jié)果通過NCBI 進行BLAST 比對，檢驗所得序列是否為PEDV，并通過軟件DNAman 進行序列拼接，然后與GenBank 國內(nèi)外PEDV 相關(guān)的基因序列進行比對，再利用DNAstar、MEGA 軟件分析PEDV 各毒株間的遺傳演化關(guān)系。參比毒株信息詳見表3。

表3 本試驗所用的S 基因參比毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 S 基因的RT-PCR 擴增

以提取的病料樣品總RNA 為模板，對19 個PEDVS基因進行一步法RT-PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可分別見到大小為2 333、823、3 614 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符（圖1～圖3）。

圖1 引物S1-F/S1-R 擴增結(jié)果

圖2 引物S2-F/S2-R 擴增結(jié)果

圖3 引物S3-F/S3-R 擴增結(jié)果

2.2 S 基因序列分析

試驗獲得的19 個PEDV 地方流行毒株的S基因全長由4 158～4 161 nt 組成，其中僅JX1、JX2 毒株的長度為4 158 nt，其余毒株的長度均為4 161 nt。與經(jīng)典株CV777 比對發(fā)現(xiàn)：這19 個毒株在167 nt 處均插入1 個堿基G，在176～177 nt 處均插入2 個堿基AG，在183～191 nt 處均插入9 個堿基，在209 nt處均插入1 個堿基G，在221 nt 處均缺失1 個堿基A，在438～440 nt 處均插入3 個堿基ATG，在496～501 nt 處均缺失6 個堿基，而僅毒株JX1、JX2 還在3 624～3 626 nt 處缺失3 個堿基。

S基因同源性分析得出，19 個毒株與經(jīng)典株CV777 的同源性為93.8%～94.1%，其彼此之間的同源性為97.7%～100%，遼寧4 個毒株之間的同源性為100%，江西5 個毒株之間的同源性為98.4%～100%，福建3 個毒株間的同源性為99.9%～100%，河南5 個毒株之間的同源性為100%。19 個流行株與Chinju99、KNU-0801、DR13、SM98 等韓國毒株的同源性為93.1%～99.5%，與NK、KH、83p～5、MK、14JM～146、JMi-277-fSnorCo13 等日本毒株的同源性為93.2%～99.7%，與荷蘭毒株NL-GD002-2017的同源性為94.2%～95.9%，與GeneBank 中其他我國流行毒株的同源性為93.6%～99.8%。

進化樹構(gòu)建分析表明（圖4），試驗的19 個流行毒株以及61 個PEDV 參考毒株被分為2 個大群（Group，G），即G1 和G2。其中19 個流行毒株均處于G1 群中，但與6 個韓國毒株、5 個日本毒株及我國其他地區(qū)流行株分別處于G1 大群中的不同分支中，G2 群則包括經(jīng)典株CV777、韓國弱毒株DR13、日本弱毒株83P-5 等共21 個毒株。G1 和G2 群中的毒株均存在堿基突變、插入和缺失現(xiàn)象，但G1 群中的毒株以堿基插入為主，而G2 群中的毒株則以堿基缺失為主。

2.3 基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析

試驗所獲得的19 株流行毒株推導(dǎo)的S 蛋白氨基酸，僅JX1 和JX2 兩個毒株由1 386 aa 構(gòu)成，而其他毒株均由1 387 aa 組成。與經(jīng)典株CV777 的S蛋白氨基酸序列相比，19 個毒株的S 蛋白氨基酸均存在點突變、氨基酸插入和缺失現(xiàn)象。19 個毒株在59～62 aa 處，均插入4 個氨基酸QGVN；在145 aa處，均插入1 個氨基酸N；在168～169 aa 處，均缺失2 個氨基酸DI；而在1 208 aa 處，僅毒株JX1、JX2缺失1 個氨基酸。

有研究表明，PEDV S 蛋白可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，其抗原表位區(qū)域499～638 aa，以及線性表位758PVLVYSNIGVCKSGSI773（S1D5）、770SGSIGYCPLSQDGQVKI785（S1D6）、1382GPRLQPY1388（2C10）都可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[4-6]。線性表位S1D5 和2C10 在19 個毒株中都非常保守，沒有發(fā)生氨基酸突變，而在表位S1D6 中19 個毒株均有1個氨基酸發(fā)生了突變，由Y 變成了S。在506 aa 處，江西5 個毒株和福建3 個毒株均由I 突變成T，在511 aa 處，河南5 個毒株均由L 突變成P，在527 aa處，遼寧4 個毒株、河南5 個毒株、ZJ11 和HuBXN1均由A 突變成S，19 個毒株在531、533、537、559、604、615 和626 aa 處均各存在1 個氨基酸點突變。在573 aa 處，僅福建3 個毒株的氨基酸由K 突變成N，在547 aa 和593 aa 處，僅JX1、JX2 兩個毒株存在1 個氨基酸點突變。

圖4 PEDVS 基因遺傳進化樹

S 蛋白氨基酸序列同源性分析表明，19 個毒株與標準株CV777 的同源性為92.8%～93.4%，其彼此之間的同源性為97.7%～99.9%，與Chinju99、KNU-0801、DR13、SM98 等韓國毒株的同源性為91.9%～99.1%，與NK、KH、83p～5、MK、14JM-146、JMi-277-fSnorCo13 等日本毒株的同源性為92.5%～99.7%，與荷蘭毒株NL-GD002-2017 的同源性為93.8%～95.1%，與GeneBank 中我國其他地方毒株的同源性為91.9%～99.6%。

3 討 論

PED 已成為約束我國畜牧業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，免疫豬場也有暴發(fā)，說明其免疫效果欠佳，提示PEDV 可能發(fā)生了變異[7]。試驗獲得的19 株地方流行毒株中，僅JX1、JX2 兩個毒株的S基因長度為4 158 nt，其他毒株均為4 161 nt，主要原因是JX1、JX2 毒株在3 624～3 626 nt 處缺失了3 個堿基。與經(jīng)典株CV777 的S基因序列相比，我國流行株存在堿基的插入和缺失現(xiàn)象，但以堿基插入為主。進化樹構(gòu)建結(jié)果中，試驗獲得的19 個流行毒株均處于G1 群中，但與6 個韓國毒株、5 個日本毒株及我國2013-2018年的流行毒株分別處于G1 大群中的不同分支中，表明韓國、日本毒株及我國近年流行株雖與2011-2012年間我國PEDV 流行株有較高的親緣性，但已發(fā)生了一定程度的變異。經(jīng)典株CV777 處于G2 群中，而G2 群不僅有我國往年的流行株，還有韓國弱毒株DR13、日本弱毒株83P-5 以及我國的細胞適應(yīng)株SD-M 等毒株。說明PEDVS基因一直處于變異進化過程中，提高疫苗的保護效率，研發(fā)新型疫苗是防治PED 的關(guān)鍵所在。

S基因序列同源性比較分析結(jié)果中，河南5 個毒株之間的同源性高達100%，遼寧4 個毒株之間的同源性也為100%，江西5 個毒株之間的同源性為98.4%～100%，福建3 個毒株間的同源性為99.9%～100%，且試驗的19 個地方流行株與Gen－Bank 中我國其他流行株的同源性要普遍高于日本、韓國、荷蘭毒株，說明PEDV 在我國部分省份區(qū)域流行中具有一定程度的保守性，但在各國的流行中，毒株變異程度較大，這可能與流行地域的環(huán)境、氣候、溫度等各方面的因素有關(guān)。

PEDV S 蛋白中擁有可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原區(qū)域499～638 aa 和線性抗原表位S1D5、S1D6、2C10。將試驗的19 個流行株與參考株CV777 進行比對發(fā)現(xiàn)：線性表位S1D5 和2C10 在19 個毒株中都非常保守，沒有發(fā)生氨基酸突變、插入和缺失，而在表位S1D6 中19 個毒株均有1 個氨基酸發(fā)生了突變。在抗原區(qū)域499～638 aa 處，19 個流行株均有氨基酸點突變現(xiàn)象，但沒有氨基酸的缺失和插入，僅JX1、JX2 兩個毒株的氨基酸序列在此區(qū)域內(nèi)的突變數(shù)為10，其他流行株的突變數(shù)為9，19 個流行株在此區(qū)域內(nèi)的突變率達6.4%～7.1%。有研究表明，同是冠狀病毒科正連單股RNA 病毒的雞傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus，IBV），當(dāng)其S1 蛋白有2%～3%的氨基酸發(fā)生變異時就會引起血清型的改變，當(dāng)差異達5%時就可導(dǎo)致差的交叉保護[8]。目前，PEDV 只發(fā)現(xiàn)1 個血清型，因而其氨基酸變化沒有引起血清型的改變，但是否會引起差的交叉保護還無法確定。

4 結(jié) 論

試驗獲得的19 個PEDV 毒株屬我國PED 疫情的主要流行毒株，且發(fā)生了一定程度的變異。