王金良，于新友，陳金龍，沈志強，

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600；2.山東綠都生物科技有限公司 256600）

非洲豬瘟于1921 年首次發(fā)生于非洲肯尼亞， 是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種烈性傳染病，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、急性和高死亡率，剖檢主要變化為脾增大、淋巴組織壞死和出血、凝血不良等；在1957 年以前，該病一直在非洲中部和南部國家流行， 之后傳入歐洲的葡萄牙等國家，1970 年開始呈世界多地區(qū)流行， 包括意大利、 西班牙、巴西、 古巴等國家， 給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。2018 年非洲豬瘟呈現(xiàn)全球大爆發(fā)、大流行態(tài)勢，新增疫情國家數(shù)同比上升30%，同年8 月ASF 傳入我國，截止2019 年7 月共發(fā)生疫情143 起，撲殺生豬116 萬頭，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來沉重打擊。

目前，ASF 尚無有效疫苗用于預防，防控主要依靠嚴格的生物安全措施， 輔以準確、 快速的病原檢測技術(shù)。 ASFV 為雙鏈DNA 病毒，也是蟲媒DNA 病毒，病毒直徑約200nm，正六邊形，依據(jù)病毒主要衣殼蛋白p72 基因序列，ASFV 可分為24 個不同基因型，同時p72 蛋白也是ASF 血清學檢測的主要應用抗原。為了更好防控非洲豬瘟的發(fā)生， 國內(nèi)外學者開展了非洲抗原抗體快速檢測技術(shù)的研究，包括免疫熒光、ELISA、免疫層析試紙條、PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導等溫擴增等方法[1-3]。 本文選取了商品化的基于熒光定量PCR、 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的試劑盒進行了初步比較，旨在為產(chǎn)品的選擇使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3 種商品化ASFV 核酸檢測試劑盒，ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒 （試劑盒反應液為液體制劑） 為A 廠家產(chǎn)品、ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒（反應液為凍干制劑）為B 廠家產(chǎn)品、非洲豬瘟病毒可視化DNA 檢測試劑盒（反應液為液體制劑）為C 廠家產(chǎn)品，檢測樣品為非洲豬瘟病毒B646L 基因質(zhì)粒標準物質(zhì)（標準物質(zhì)編號GBW(E) 091034）；所用儀器為英國MyGo pro 熒光PCR儀。

1.2 試驗方法

將非洲豬瘟病毒B646L 基因質(zhì)粒標準物質(zhì)進行10 倍比稀釋（1 號樣品為6×102拷貝/μL、2 號樣品為6×101拷貝/μL、3 號樣品為6×100拷貝/μL、4 號樣品為6×10-1拷貝/μL、5 號樣品為6×10-2拷貝/μL、6 號樣品為6×10-3拷貝/μL、7 號樣品為6×10-4拷貝/μL），確定可檢出限并計算PCR 加樣體系中基因拷貝濃度；通過重復檢測3 次最低拷貝數(shù)的樣品，確定3 種商品化ASFV 核酸檢測試劑盒的批內(nèi)重復性。

ASFV 熒光定量PCR 檢測試劑盒的加樣體系和反應程序：加樣體系均為20μL （反應液10μL、 引物混合物7.5μL、 模板2.5μL）；反應程序：95℃、30 sec，95℃、5 sec，60℃、20 sec，35 個循環(huán)。

ASFV 可視化DNA 檢測試劑盒的加樣體系和反應程序：加樣體系 （恒溫擴增反應液18μL、Bst DNA 聚合酶1μL、 模板1μL）；反應程序：64℃反應50min。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種試劑盒敏感性比較

從圖1 中可知，3 種試劑盒均具有較高的敏感性，試劑盒A敏感性最高，試劑盒B 敏感性次之，試劑盒C 的敏感性為最低，反應終體系模板拷貝數(shù)分別為0.75 拷貝/μL、7.5 拷貝/μL 和30拷貝/μL；試劑盒C 為目測法進行結(jié)果判定，而試劑盒A 和B 均借助儀器進行結(jié)果判讀， 判定方式的差異是試劑盒C 敏感性低的原因之一。

圖1 三種試劑盒敏感性比較

表1 3 種試劑盒批內(nèi)檢測穩(wěn)定性比較

2.2 三種試劑盒重復性比較

選取三種試劑盒的同一批次的3 個試劑盒， 分別進行試劑盒最低檢出量的樣品的檢測（試劑盒A 檢測3 號樣品、試劑盒B檢測2 號樣品、試劑盒C 檢測1 號樣品），結(jié)果表明這三種試劑盒重復試驗的結(jié)果均較好， 其中試劑盒A 和B 的批內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，試劑盒C 均可通過肉眼進行陽性結(jié)果的判定。

3 討論

非洲豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大，一旦發(fā)病，死亡率極高，嚴重影響世界各國的社會經(jīng)濟發(fā)展。 我國自非洲豬瘟暴發(fā)以來，各級政府高度重視疫情的防控工作， 希望在疫情發(fā)生的初期加以控制，最終推動非洲豬瘟的根除計劃。 目前，還沒有非常有效的非洲豬瘟疫苗，嚴格的生物安全防控，并結(jié)合快速、敏感的病毒檢測技術(shù)是控制非洲豬瘟發(fā)生、流行的主要方式[4,5]。

依據(jù)本文比較研究結(jié)果，3 種商品化的試劑盒均有很好的可重復性，可用于非洲豬瘟病毒的核酸檢測。 三種試劑盒的設(shè)計各有不同，也導致了試劑盒的敏感性的略有差異，如果檢測樣品來源于具有臨床癥狀的豬， 由于被檢測樣本含有較高的病毒含量，3 種試劑盒檢測結(jié)果不會有差異，若是無臨床癥狀的豬，或病毒含量低的檢測樣品， 可視化的試劑盒C 則有可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果；目前，基于凍干技術(shù)的非洲豬瘟檢測試劑類的產(chǎn)品（如試劑盒B），生產(chǎn)工藝上得到很大的改進，由于預分裝并凍干，這在一定程度上減少了檢測用時，降低了運輸、儲藏條件，凍干過程對檢測用酶制劑有如何影響還未見有相關(guān)研究報道； 可視化DNA 檢測試劑盒因其對實驗室條件、 檢測人員技術(shù)水平要求相對不高，可以對臨床樣本進行快速診斷，得到越來越多的應用，如能結(jié)合儀器進行結(jié)果判斷，不但可以降低人為因素的誤判，也在一定程度上會提高檢測試劑盒的敏感性。 因此，隨著非洲豬瘟防控的不斷深入，將會有更多的新技術(shù)、新方法應用于非瘟病毒核酸的檢測，哪種產(chǎn)品或方法更為適合，最終要依據(jù)檢測的目標樣品。