(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014060)

腎纖維化(renal fibrosis)幾乎是各種致病因素導(dǎo)致的腎臟疾病進(jìn)展到后期的共同結(jié)果,是各種慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期的主要病理學(xué)表現(xiàn)之一[1]。從中醫(yī)學(xué)的角度來看,腎纖維化起因是外邪侵襲,正氣不足、疲血阻絡(luò)、正氣不足為病機(jī)之本,夾實(shí)邪為病機(jī)之關(guān)鍵,濕、毒、虛、瘀貫穿疾病始終。早期防治乃至盡早逆轉(zhuǎn)腎纖維化防治腎病發(fā)展是治療腎纖維化的最終目標(biāo),具有深遠(yuǎn)的社會意義。

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)蒙名為烏蘭-布衣勒斯[2],為主要的木本油料樹種之一,其油可供食用。蒙古扁桃作為傳統(tǒng)的中藥,性平、味苦,具有利尿消腫作用,能行全身之水氣,改善陰虛,因此,對蒙古扁桃在防治腎纖維化方面進(jìn)行研究,為抗纖維化藥物的挖掘具有十分重要的意義。近年來對蒙古扁桃化學(xué)成分研究表明,蒙古扁桃中含有不飽和脂肪酸、苦杏仁苷、有機(jī)酸類、蛋白質(zhì)、黃酮類、多糖類、生物堿類及α-VE等多種藥用成分[3-8]。中藥因其成分復(fù)雜,作用于多種靶細(xì)胞起效,在治療過程中發(fā)揮整體的優(yōu)勢。現(xiàn)代研究表明,不同器官纖維化雖然發(fā)病的組織器官不同,但是發(fā)病機(jī)制和臟器的實(shí)質(zhì)性病理改變在一段時間內(nèi)是相同的[9]。課題組前期已證實(shí)蒙古扁桃具有較好防治肝、肺、腎纖維化作用[10-11],但抗腎纖維化具體有效作用部位有待進(jìn)一步明確。

本文在以往研究的基礎(chǔ)上,采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)制備模型,測定各實(shí)驗(yàn)組大鼠24 h尿量,腎系數(shù),血清和腎組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP)、血清中肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)等,篩選蒙古扁桃藥材抗腎纖維化的具體作用部位,為深度利用蒙古扁桃資源、進(jìn)一步開發(fā)蒙古扁桃新的藥理作用及抗纖維化藥物的挖掘提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒙古扁桃藥材 采自內(nèi)蒙古阿拉善盟巴彥諾日公,由包頭醫(yī)學(xué)院石松利教授鑒定為蒙古扁桃;實(shí)驗(yàn)動物:雄性SPF級SD大鼠70只 購回時體質(zhì)量170～200 g,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部,許可證號SCXK(京)2017-0005;鹽酸貝那普利 北京諾華制藥有限公司;戊巴比妥鈉 德國默克公司;羧甲基纖維素鈉 分析純,天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;注射用青霉素鈉 華北制藥股份有限公司;MDA試劑盒、SOD試劑盒、HYP試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒、Masson染色試劑盒、Scr試劑盒、BUN試劑盒、ALB試劑盒等 南京建成生物工程研究所。

酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限責(zé)任公司;一次性使用真空采血管 江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司;MS-700研磨機(jī) 寧波美善美心電器有限公司;AU640 全自動生化分析儀 日本奧林巴斯公司;XH6080 放免儀 西安核儀廠;TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;NP-T 生物組織自動脫水機(jī) 孝感市諾普電子科技有限責(zé)任公司;NP-B 型生物組織包埋機(jī) 孝感市諾普電子科技有限責(zé)任公司;RM2235 切片機(jī) 德國徠卡公司;JP-031S數(shù)字型超聲波清洗機(jī) 深圳市結(jié)盟清洗設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒙古扁桃藥材不同極性提取物的制備 將蒙古扁桃種仁去外殼,研碎后,置于索氏提取器中,用10倍量的95%乙醇、90 ℃水浴提取2次,每次2 h;再用10倍量的70%乙醇提取1次,每次2 h,得粗提液[12]。用減壓蒸發(fā)裝置和水浴鍋濃縮提取液至浸膏狀,計算出膏率,出膏率=浸膏重量/藥材投入量×100,為21.06%。粗浸膏使用超聲波清洗機(jī)振蕩使其均勻分散于蒸餾水中,依次用極性由小到大的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,合并相同極性部位的萃取液[13]減壓濃縮后計算各部分提取物得率,各部分提取物得率=各部分萃取物重量/粗浸膏重量。計算結(jié)果分別為:石油醚提取物56.45%,乙酸乙酯提取物2.08%、正丁醇提取物30.76%、水提取物10.71%。

1.2.2 動物分組及給藥劑量 大鼠購回適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,動物飼養(yǎng)室溫度為22～27 ℃,相對濕度為50%±5%,每組10只,隨機(jī)分為7組,分為假手術(shù)組、模型組、貝那普利組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組和水部位組。大鼠于造模前給藥,蒙古扁桃藥材提取物不同極性部位組均按生藥量1.5 g/kg大鼠體重灌胃給藥[12]。陽性藥鹽酸貝那普利按1.5 mg/kg大鼠體重灌胃給藥,假手術(shù)組和模型組5 mL/kg大鼠體重灌胃生理鹽水,每天一次,自由飲食,觀察大鼠的基本情況及死亡情況,21 d后處死大鼠。

1.2.3 模型制備 本實(shí)驗(yàn)采用成熟穩(wěn)定而且重現(xiàn)性良好的單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)制備大鼠腎纖維化模型[14],根據(jù)體重按35 mg/kg給予3%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉,固定于鼠板上,將手術(shù)用器械用75%酒精擦拭消毒,手術(shù)區(qū)域脫毛備皮,用碘酒消毒手術(shù)區(qū)域后,將大鼠仰臥固定于鼠板上,沿大鼠左肋骨邊緣下方1.5 cm處向外橫切口2 cm,剪開外皮后分離腹膜,暴露左腎,用鑷子鈍性剝離左腎周圍的脂肪、筋膜等組織,分離出左側(cè)輸尿管后用手術(shù)縫合線進(jìn)行結(jié)扎,結(jié)扎后再逐層縫合大鼠皮毛組織,假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管,不結(jié)扎,最后將青霉素鈉溶液涂于傷口防止傷口感染。

1.2.4 樣本采集 造模手術(shù)21 d后,禁食不禁水,于末次給藥 24 h 后,眼眶靜脈叢采血,測定Scr、BUN、ALB,然后置于代謝籠內(nèi)接取24 h尿量后再稱大鼠體重后,用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,仰臥位固定于鼠板上,打開腹腔,先取腹主動脈血,再摘取雙側(cè)腎臟,觀察結(jié)扎側(cè)腎臟外觀顏色、質(zhì)地、形態(tài)等情況,用生理鹽水清洗后,濾紙擦去水分,用電子天平稱左側(cè)腎的重量,計算腎系數(shù)。從左側(cè)腎臟橫切一半組織固定于4%甲醛溶液中,做病理切片。另一半用于制備腎組織勻漿,檢測組織勻漿中SOD、MDA、HYP。所采腹主動脈血液置于4 ℃冷凍離心機(jī)中,3000 r/min、10 min分離血清,檢測血清SOD、MDA。

1.2.5 指標(biāo)測定

1.2.5.1 大鼠的一般情況 每天觀察記錄各組大鼠的皮毛顏色變化、進(jìn)食飲水量、排泄情況以及活動情況。

1.2.5.2 觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化 觀察雙側(cè)腎臟的顏色、質(zhì)地、形態(tài)、體積等外表變化。

1.2.5.3 記錄大鼠24 h尿量計算腎系數(shù) 收集各組大鼠24 h尿量并記錄;處死大鼠后摘取梗阻側(cè)腎臟,稱重,計算腎系數(shù)(腎系數(shù)(%)=梗阻側(cè)單側(cè)腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100)。

1.2.5.4 觀察腎臟病理組織學(xué)結(jié)果 對梗阻側(cè)腎臟病理切片進(jìn)行HE和Masson染色后,置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理組織學(xué)變化,并記錄結(jié)果。

1.2.5.5 測定大鼠血清Scr、BUN、ALB含量 根據(jù)試劑盒的指示步驟進(jìn)行含量測定,計算結(jié)果并做詳細(xì)記錄。

1.2.5.6 測定大鼠血清SOD活力、MDA含量 根據(jù)試劑盒的指示步驟進(jìn)行含量測定,計算結(jié)果并做詳細(xì)記錄。

1.2.5.7 測定大鼠腎組織 SOD活力、MDA和HYP含量 根據(jù)試劑盒的指示步驟進(jìn)行含量測定,計算結(jié)果并做詳細(xì)記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 腎纖維化大鼠模型造模結(jié)果

各組大鼠造模21 d后,采血,測定其腎纖維化相關(guān)指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知,與假手術(shù)組相比,腎纖維化模型組、陽性鹽酸貝那普利藥組及蒙古扁桃藥材不同極性提取物組大鼠血清中的BUN、Scr、ALB含量均顯著升高(P<0.05),表明模型組大鼠存在腎臟代謝紊亂,腎纖維化模型造模成功。

表1 腎纖維化大鼠模型造模結(jié)果Table 1 Modeling results of rat

2.2 大鼠的一般情況

單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)后1 h內(nèi)各手術(shù)組大鼠均蘇醒,剛蘇醒后精神狀態(tài)較差,短時期內(nèi)活動量減少,手術(shù)傷口沒有出現(xiàn)感染。手術(shù)后的假手術(shù)組大鼠,前期進(jìn)食及飲水較術(shù)前稍減少,恢復(fù)幾天后機(jī)體逐漸恢復(fù)至正常。模型組大鼠術(shù)后飲食減少,毛色發(fā)黃,精神低靡,活動行為遲緩。

2.3 大鼠腎臟的形態(tài)學(xué)變化

處死大鼠后摘取各個臟器,觀察雙側(cè)腎臟(圖1),可見假手術(shù)組大鼠的雙側(cè)腎臟外觀色澤正常,呈扁豆?fàn)?雙側(cè)大小基本一致,呈紫紅色,組織富有彈性,被有光滑的薄膜,切開時阻力很小,切面經(jīng)生理鹽水漂洗后可見皮質(zhì)髓質(zhì)分界清楚。模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟與正常側(cè)腎相比,體積明顯增大,淺褐色,呈囊狀,腎組織內(nèi)有積液,被有凹凸不平的白色薄膜,切開時阻力較大,有黃褐色的液體流出。觀察各處理組腎臟切開后經(jīng)生理鹽水漂洗后的切面可見皮質(zhì)部分變薄,皮髓質(zhì)分界模糊不清,其中模型組最為嚴(yán)重,蒙古扁桃石油醚、正丁醇提取物組和陽性藥組上述情況有所改善。

圖1 蒙古扁桃不同極性提取物對腎纖維化大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Morphological changes of kidney in rats with renal fibrosis induced by different polar extracts of Amygdalus mongolica

2.4 24 h尿量和腎系數(shù)計算

由圖2可知,模型組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比,24 h尿量極顯著減少(P<0.01),腎系數(shù)極顯著升高(P<0.01),說明模型穩(wěn)定,造模成功;與模型組相比,陽性藥組大鼠24 h尿量極顯著增加(P<0.01),蒙古扁桃正丁醇提取物大鼠24 h尿量顯著增加(P<0.05),陽性藥組、蒙古扁桃石油醚和正丁醇提取物組的腎系數(shù)顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明,蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物對腎纖維化大鼠具有保護(hù)作用。

圖2 蒙古扁桃不同極性提取物對腎纖維化大鼠尿量和腎系數(shù)的影響Fig.2 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on urine volume and renalcoefficient in rats with renal fibrosis(x±s,n=10)注:##:與假手術(shù)組相比,差異極顯著,P<0.01;*:與模型組相比差異顯著,P<0.05,**:與模型組相比差異極顯著,P<0.01;模:模型組,假:假手術(shù)組,陽:陽性藥組,石:石油醚提取物組,乙:乙酸乙酯提取物組,正:正丁醇提取物組,水:水部位組;圖5～圖7同。

2.5 腎纖維化大鼠病理組織學(xué)結(jié)果

圖3病理切片HE染色鏡下觀察顯示:假手術(shù)組大鼠腎組織的腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)均正常,未出現(xiàn)異常病變,模型組腎小管損傷范圍較大,間質(zhì)內(nèi)可見片狀分布的炎性細(xì)胞,有灶狀纖維化出現(xiàn),蒙古扁桃藥材不同極性部位提取物給藥組的腎組織中腎小管及腎間質(zhì)病變也隨著時間逐漸加重,陽性藥組、石油醚提取物組與正丁醇提取物組相比模型組病變較輕,腎間質(zhì)中炎性細(xì)胞減少。

圖3 蒙古扁桃不同極性提取物對腎纖維化大鼠腎臟病理組織學(xué)的影響(HE染色,200×)Fig.3 Effect of different polar extracts of Amygdalus mongolicaon renal histopathology of rats with renal fibrosis(HE staining,200×)

圖4 Masson染色鏡下觀察顯示:假手術(shù)組大鼠的腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)均未見異常病理改變;模型組大部分腎小管出現(xiàn)明顯萎縮,間質(zhì)變寬,充滿炎性細(xì)胞,可見灶狀纖維化的出現(xiàn)。蒙古扁桃石油醚提取物組、正丁醇提取物組及陽性藥組腎組織中腎小管及腎間質(zhì)均產(chǎn)生病變;與模型組相比,蒙古扁桃石油醚提取物組,正丁醇提取物組的腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤減輕,腎小管較輕損傷,間質(zhì)纖維化程度減弱,可以直觀地觀察到蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物以及鹽酸貝那普利對腎纖維化大鼠具有保護(hù)作用。

圖4 蒙古扁桃不同極性提取物對腎纖維化大鼠腎臟病理組織學(xué)的影響(Masson染色,200×)Fig.4 Effects of different polar extracts of Amygdalus mongolica on renalhistopathology in rats with renal fibrosis(Masson staining,200×)

2.6 血清中BUN、Scr、ALB含量結(jié)果

如圖5所示,模型組與假手術(shù)組相比,血清中BUN、Scr、ALB含量極顯著增高(P<0.01);與模型組相比,陽性藥貝那普利組大鼠血清中的BUN、Scr、ALB水平顯著降低(P<0.05),而蒙古扁桃正丁醇提取物組大鼠血清中的BUN、ALB水平顯著降低(P<0.05),Scr水平極顯著降低(P<0.01);石油醚提取物組大鼠血清中Scr和ALB的水平顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明,蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物對腎纖維化大鼠的腎臟具有保護(hù)作用。

圖5 蒙古扁桃不同極性提取物對腎纖維化大鼠血清BUN、Scr、ALB的影響Fig.5 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on serum BUN,Scrand ALB in rats with renal

2.7 血清中SOD活力和MDA含量結(jié)果

如圖6所示,與假手術(shù)組相比,模型組血清中的SOD活力極顯著降低(P<0.01),血清MDA含量極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,蒙古扁桃石油醚提取物組、正丁醇提取物組和陽性藥鹽酸貝那普利組的大鼠血清中SOD活力顯著升高(P<0.05),蒙古扁桃石油醚提取物組和正丁醇提取物組的大鼠血清中MDA含量顯著降低(P<0.05),陽性藥鹽酸貝那普利組的大鼠血清中MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

圖6 蒙古扁桃不同極性提取物對腎纖維化大鼠血清SOD、MDA的影響Fig.6 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on serum SOD and MDAin rats with renal

2.8 腎組織中SOD活力和MDA、HYP含量結(jié)果

如圖7所示,與假手術(shù)組相比,模型組腎組織中SOD活力極顯著降低(P<0.01),MDA、HYP水平極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,蒙古扁桃石油醚提取物組、正丁醇提取物組和陽性藥鹽酸貝那普利組大鼠腎組織中的SOD活力顯著升高(P<0.05),MDA、HYP水平顯著降低(P<0.05)。

圖7 蒙古扁桃不同極性部位提取物對大鼠腎組織中SOD、MDA和HYP的影響Fig.7 Effects of extracts from different polar parts ofAmygdalus mongolica on SOD,MDAand HYP in rat

3 結(jié)論與討論

綜合本研究結(jié)果篩選出蒙古扁桃藥材提取物抗腎纖維化的有效作用部位是石油醚部位和正丁醇部位。腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病的常見病理學(xué)結(jié)果,其特征主要包括腎小管萎縮,炎性細(xì)胞浸潤,纖維母細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞激活,細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解無法處在動態(tài)平衡狀態(tài)中[15-17]。纖維化是細(xì)胞、組織損傷修復(fù)的結(jié)果,主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多,實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少。內(nèi)源性或外源性致病原引起腎組織損傷,啟動機(jī)體保護(hù)性的炎癥反應(yīng)與修復(fù)過程,造成機(jī)體代謝紊亂,從而使腎功指標(biāo)和血清內(nèi)各項(xiàng)生化指標(biāo)出現(xiàn)異常。

本研究的造模方法采用的是單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù),來制備大鼠腎纖維化的模型,單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)所導(dǎo)致的大鼠腎纖維化模型,是目前廣泛采用的公認(rèn)的可以誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化病變的造模方法,是一種符合臨床慢性腎衰特點(diǎn)的經(jīng)典動物造模方法。陽性藥物對照選用的是鹽酸貝那普利,屬于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制藥,抑制血管緊張素Ⅱ的形成,可使血漿醛固酮水平降低、使血管舒張、降低血壓,緩解機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、增加腎小球?yàn)V過率、減少蛋白尿等發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[18-20]。本研究通過對腎臟病理組織切片HE和Masson染色,在顯微觀察蒙古扁桃不同極性提取物對模型大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的改變,同時評估大鼠尿量,腎臟臟器指數(shù),BUN、Scr及ALB水平,檢測大鼠血清中SOD、MDA的表達(dá),組織中SOD、MDA及HYP的表達(dá),從多個環(huán)節(jié)篩選出蒙古扁桃藥材抗腎纖維化的有效作用部位是石油醚部位和正丁醇部位,為進(jìn)一步開發(fā)蒙古扁桃新的藥理作用及抗纖維化藥物的挖掘提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

肌酐(Scr)是生物體肌肉內(nèi)的磷酸肌酸經(jīng)過水解而生成的,在生理狀態(tài)穩(wěn)定的機(jī)體內(nèi)肌酐的產(chǎn)生與代謝正常,但當(dāng)由各種因素導(dǎo)致腎臟病變后,腎小球的濾過率會降低,機(jī)體內(nèi)肌酐的含量相比于正常機(jī)體會明顯升高。機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物是尿素氮,正常情況下血液中的尿素氮可以全部經(jīng)腎小球?yàn)V過后,被腎小管重吸收,當(dāng)腎臟受到損傷,體內(nèi)尿酸排出減少,產(chǎn)生蓄積,造成血液中的尿素氮水平升高[21-25]。所以血清中肌酐、尿素氮的水平波動可以在一定程度上反映腎小管的病變程度。氧化應(yīng)激反應(yīng)與腎纖維化密切相關(guān),羥脯氨酸膠原蛋白的主要成分之一,其羥脯氨酸含量與腎間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)[26]。本次研究結(jié)果顯示,蒙古扁桃藥材石油醚提取物給藥組與正丁醇給藥組的血清與組織SOD活性與模型組相比顯著升高(P<0.05),血清及組織中MDA水平則顯著降低(P<0.05),蒙古扁桃藥材石油醚提取物和正丁醇提取物可能具有清除機(jī)體內(nèi)活性氧和抵抗脂質(zhì)過氧化作用來維持機(jī)體正常代謝。