郭浩然,鄭心怡,張 靜,李小定

(環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

花青素(Anthocyanin)又稱為花色素,在天然狀態(tài)下花青素常與各種單糖結(jié)合形成花色苷[1]?；ㄇ嗨赜休^強(qiáng)的體外抗氧化能力,可以作為氧自由基的清除劑,可以保護(hù)H2O2引起的細(xì)胞凋亡[2]。并且花色苷具有顯著的抗疲勞作用[3],對血糖調(diào)節(jié)、降低血脂、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)有重要作用[4],對于治療心血管疾病也具有重要的意義[5]。桑葚富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和有效的生物活性物質(zhì)[6],有明目、保肝、降血壓等作用[7]。桑葚的儲藏性較差,含糖量較高且酸度適宜,是一種較好釀酒原料[8]。近年來,有研究表明,在長時間存放的果酒和果汁中存在一類吡喃型花青素衍生物。這類吡喃型花青素相對于普通花青素呈現(xiàn)出更高的pH、SO2以及儲藏穩(wěn)定性,具有更加優(yōu)越的色澤穩(wěn)定性[9];并且,吡喃型花青素具有一定的抗氧化能力、抗癌和抗炎癥等生理活性功能[10],這些發(fā)現(xiàn)均為花青素廣泛應(yīng)用于食品從而發(fā)揮其生理功能提供了新的可能。

常用的花青素分析方法主要有高效液相色譜法、單一pH法、差減法和pH示差法等[11-16]。其中pH示差法的原理是基于花青素在不同pH環(huán)境中結(jié)構(gòu)和呈色轉(zhuǎn)變是pH的函數(shù),而樣品中其他干擾物的特征光譜卻不會隨環(huán)境pH變化而變化,通過加入不同pH緩沖溶液后測定吸光值,根據(jù)兩者最大的吸光值的差異通過公式計(jì)算出花青素的含量[17]。pH示差法測定花青素的含量不需要純度較高的標(biāo)準(zhǔn)品,因此該方法成本較低,并且操作簡便,是花青素定量分析最常用的方法之一。一般在使用pH示差法前,需要對測定波長、使用緩沖液的pH、反應(yīng)的平衡溫度和時間進(jìn)行確定,以達(dá)到最準(zhǔn)確的測定效果。測定波長的確定大多研究方法是選擇花青素處理液的最大吸收波長,通常在520 nm左右;緩沖液pH則是選擇兩個具有最大吸光值差異且較為穩(wěn)定的pH。pH示差法的反應(yīng)平衡溫度一般不會選擇較高溫度,因?yàn)闇囟葘ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性有較大的影響[18];而對于反應(yīng)平衡時間,不同研究報(bào)道的平衡時間具有一定差異,因?yàn)榛ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性與其所處的食品基質(zhì)的酸度、加工方式有很大關(guān)系[19]。

本文在以上研究的基礎(chǔ)上,為獲得發(fā)酵酒及其他發(fā)酵飲品中花青素測定的優(yōu)化方法,對pH示差法測定桑葚酒中花青素含量的最佳測定波長、緩沖液的最適pH、平衡溫度和時間等條件進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行方法學(xué)評價,為今后pH示差法應(yīng)用于發(fā)酵酒中花青素測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚干紅 由湖北省圣源酒業(yè)提供;矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 色譜級,成都瑞芬思生物技術(shù)有限公司;乙酸、乙酸鈉、鹽酸、氯化鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑;蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

紫外分光光度計(jì) 日本島津有限公司;721可見分光光度計(jì) 天津冠澤科技有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 緩沖液的配制 配制不同pH的緩沖液,具體方法參考文獻(xiàn)[14]。pH為0.5和2.0的緩沖溶液的配制:向0.1 mol/L的檸檬酸溶液中逐滴加入鹽酸,并使用pH計(jì)校準(zhǔn)至所需的pH即可。pH為1.0的緩沖液的配制:0.2 mol/L的氯化鉀溶液和0.2 mol/L的鹽酸溶液以25∶67的體積比混合。pH=4.5的緩沖液的配制:0.2 mol/L的乙酸鈉溶液與0.2 mol/L的乙酸溶液按照體積比1∶1混合后即得。pH=3、4、5、6的檸檬酸緩沖液配制方法見表1。

表1 不同pH檸檬酸緩沖液配制方法Table 1 Different pH citrate buffer configuration method

1.2.2 樣品前處理 將桑葚酒樣品裝入離心管后配平,放置于高速冷凍離心機(jī)中,以10000 r/min的速度離心15 min,吸取上層清液待用。

1.2.3 花青素的定量分析 準(zhǔn)確吸取離心后的桑葚酒1 mL至20 mL的具塞試管中,分別用pH為1.0和4.5的緩沖溶液定容至20 mL,后置于30 ℃下水浴恒溫40 min,取出試管冷卻至室溫。以蒸餾水為空白對照,分別測定用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋后在519和700 nm下的吸光值,以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì),按照Fuleki公式計(jì)算出桑葚酒中花青素的含量[20]。

ΔA=(A519 nm-A700 nm)pH=1.0-(A519 nm-A700 nm)pH=4.5

式(1)

式(2)

式中:ΔA為桑葚酒中花青素的總吸光值;A519 nm為樣品在519 nm處測定的吸光值;A700 nm為樣品在700 nm處測定的吸光值;DF為稀釋倍數(shù);M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量449.2 g/mol;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù),26900 L·mol-1·cm-1;L為光程,值為1 cm。

1.2.4 樣品測定波長的選擇 分別用pH為1.0和4.5的緩沖液稀釋處理后的桑葚酒樣品,后在520 nm處測定樣品吸光值,使得吸光值在0.2～0.7范圍左右同時不影響緩沖液的緩沖能力下,確定稀釋倍數(shù)。后將分別用兩種緩沖液稀釋一定倍數(shù)的處理液在370～800 nm進(jìn)行光譜掃描,根據(jù)吸光值的差值確定最佳吸收波長。

1.2.5 樣品測定pH的選擇 用不同pH的緩沖溶液將樣品稀釋至1.2.4中確定的稀釋倍數(shù)后,在掃描光譜中的最佳測定波長下測定吸光值,確定最適合的緩沖液pH。要求在最適pH時吸光值左右波動不大、較穩(wěn)定,且兩個緩沖pH所測吸光值具有最大的差異。

1.2.6 樣品體系反應(yīng)平衡溫度和時間的選擇 根據(jù)1.2.4和1.2.5得到的稀釋倍數(shù)和緩沖液的pH,將緩沖液稀釋過的待測液分別置于20、30、40 ℃下,以蒸餾水為空白對照,每隔10 min測定一次在最大吸收波長下的吸光值。

1.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得確定的條件,分別用pH為1.0和4.5的緩沖溶液將樣品稀釋20倍,后置于30 ℃下水浴恒溫40 min,取出試管冷卻至室溫。以蒸餾水為空白對照,分別測定用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋后在519和700 nm下的吸光值。連續(xù)8次進(jìn)行花青素的定量分析,評價條件優(yōu)化后方法的精確度。

1.2.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取一定量的矢車菊素-3-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品,溶解后用pH示差法測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液中花青素的含量,然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液的二倍和四倍稀釋。取四份處理后的桑葚酒樣品,其中一份直接利用pH示差法測定其花青素的含量。其他3份分別取10 mL,后分別加入0.1 mL的標(biāo)準(zhǔn)品原液、標(biāo)準(zhǔn)品二倍稀釋液和四倍稀釋液。分別用pH示差法測定加入標(biāo)準(zhǔn)品后樣品中花青素的含量,并根據(jù)以下公式計(jì)算加標(biāo)回收率。

其中:P為加標(biāo)回收率;C1為空白式樣測定量;C2為加入標(biāo)準(zhǔn)品后測定含量;C3為加入標(biāo)準(zhǔn)品量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

吸收光譜圖曲線如圖1所示,在370～800 nm的波長范圍下,加入pH為4.5和1.0的緩沖溶液后,兩者吸光值的差值在519 nm處有最大的吸收峰。單一的花色苷在可見區(qū)有一個最大吸收峰,且吸收帶范圍較窄,在80～100 nm之間;但是花色苷種類較為復(fù)雜時就可能有多個峰值或者更寬的吸收帶范圍[21]。且桑葚酒中花青素經(jīng)不同pH的緩沖溶液稀釋后,花青素生色團(tuán)所處的pH環(huán)境隨之發(fā)生改變,使得掃描光譜在高度和寬度發(fā)生變化或者波長發(fā)生位移,因此出現(xiàn)由pH變化引起的紫外差光譜現(xiàn)象。有研究表明矢車菊素葡萄糖苷在pH=1.0條件下最大吸收波長為510 nm,而隨pH增加最大吸收波長發(fā)生紅移,在中性條件下最大吸收波長為554 nm[22]。而花青素在不同的pH條件下有不同的存在結(jié)構(gòu)形式,當(dāng)處于pH為1.0的環(huán)境條件下,花青素以花色烊離子形式存在,呈現(xiàn)紅色;當(dāng)以pH為4.5的緩沖液稀釋時,花青素以甲醇假堿形式存在,呈無色[17],所以當(dāng)樣品其他介質(zhì)特征光譜不變時,能夠表征由花青素結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的吸光值差異最大所對應(yīng)的波長為最佳測定波長,因此519 nm為最佳測定波長。而花青素在700 nm處應(yīng)無吸收,因此選擇700 nm處作為另一測定波長,以消去食品中其他非花青素成分產(chǎn)生的影響。

圖1 桑葚酒樣品的掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectra of mulberry wine samples

此外,針對pH示差法測定花青素的波長,有研究選擇用花色苷標(biāo)準(zhǔn)品而非待測樣品在可見區(qū)掃描出的最大吸收波長或緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后掃描出的最大吸收波長[12,14],但是這種方法忽略了花青素存在的食品介質(zhì)以及pH變化對掃描結(jié)果的影響。也有學(xué)者選擇樣品掃描出的在可見區(qū)的最大吸收波長[13],但是同樣忽略了pH對花青素結(jié)構(gòu)變化的影響以及pH示差法測定花青素含量的原理。

2.2 測定緩沖液pH的選擇

在519 nm條件下,測定在pH為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的緩沖溶液中桑葚酒樣品的吸光值結(jié)果如圖2。由圖2得出,在pH為0.5時具有最大吸光值,且與pH=1.0時吸光值差異不顯著(P<0.05);在pH大于1.0后吸光值逐漸下降,并且于pH=4.5趨于穩(wěn)定,且有最小的吸光值,pH=4.5之后吸光值無顯著差異(P>0.05)。當(dāng)pH為0.5和4.5時,具有最大的吸光值的差異,然而考慮到pH為1.0時的吸光值與0.5時吸光值差異不顯著且與2.0時的吸光值不顯著,即pH為1.0左右時具有較為不顯著的吸光值波動,因此使用pH1.0和4.5的緩沖液。

圖2 不同pH條件下桑葚酒樣品的吸光值Fig.2 Absorbance of mulberry wineunder different pH conditions注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 反應(yīng)平衡時間和溫度的確定

使用pH為1.0的緩沖液將桑葚酒樣品稀釋20倍后,分別放置于20、30、40 ℃下每隔10 min測定吸光值,所得結(jié)果如圖3。在30 ℃下,測定樣品的吸光值較穩(wěn)定,當(dāng)恒溫水浴40 min后樣品吸光值基本達(dá)到平衡。在40 ℃下恒溫10～70 min時,反應(yīng)體系吸光值出現(xiàn)增加的現(xiàn)象,可能是由于溫度導(dǎo)致花青素?fù)p失同時伴隨著褐變指數(shù)和聚合物色值的增加導(dǎo)致[23]。而在80 min時出現(xiàn)吸光值下降的現(xiàn)象,這可能是由于溫度使游離型花青素分解。圖4是pH=4.5的緩沖溶液在不同溫度下吸光值隨溫度變化的結(jié)果,20 ℃下吸光值隨時間變化的波動較大;30 ℃下水浴恒溫40 min后反應(yīng)趨于平衡。因此,選擇優(yōu)化后的反應(yīng)平衡條件為30 ℃下恒溫40 min。針對pH示差法測定花青素含量的報(bào)道選擇平穩(wěn)溫度和時間一般為20 ℃下平衡100 min左右[12,16],或者是于40 ℃下平衡20～30 min[11,14]。而本文優(yōu)化后條件相比于之前研究而言,既避免了溫度較高導(dǎo)致花青素穩(wěn)定性變差,從而降低方法測定的準(zhǔn)確性,又縮短了反應(yīng)體系的平衡時間。

圖3 桑葚酒在pH=1.0條件下的平衡結(jié)果Fig.3 Balance results of mulberry wine at pH1.0

圖4 桑葚酒在pH=4.5條件下的平衡結(jié)果Fig.4 Balance results of mulberry wine at pH4.5

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述確定的條件,將桑葚酒樣品使用pH為1.0和4.5的緩沖溶液稀釋20倍,在30 ℃條件下恒溫水浴40 min,后冷卻分別在519和700 nm下測定吸光值,根據(jù)公式計(jì)算花青素的含量。按照這個方法連續(xù)取樣8次,重復(fù)測定花青素的含量。結(jié)果如表2所示,桑葚酒中花青素含量平均為23.80 mg/L,花青素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.076%。實(shí)驗(yàn)表明,使用該方法進(jìn)行桑葚酒中花青素的定量分析重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高。

表2 pH示差法測定桑葚酒中花青素含量精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision experiment results of anthocyanin content in mulberry wine by pH differential method

2.5 加標(biāo)回收率

根據(jù)上述條件優(yōu)化后應(yīng)用pH示差法測定花青素的加標(biāo)回收率結(jié)果如表3所示。當(dāng)加標(biāo)量為0.1062 mg時,平均加標(biāo)回收率為99.59%;當(dāng)加入0.0531 mg時,加標(biāo)回收率為102.70%;加標(biāo)量為0.0266 mg時,平均加標(biāo)回收率為100.6%。上述加標(biāo)回收率均在可接受范圍內(nèi),該結(jié)果表明,優(yōu)化條件后的pH示差法能夠準(zhǔn)確可靠地測定桑葚酒中花青素的含量。

表3 桑葚酒中花青素加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Anthocyanin recovery experimentresults in mulberry wine

3 討論與結(jié)論

針對pH示差法測定波長的選擇,有研究以矢車菊素葡萄糖苷在pH為1.0環(huán)境下掃描出的最大波長[12],或是選用矢車菊素葡萄糖苷在pH為1.0環(huán)境下的摩爾系數(shù)對應(yīng)的最大吸收波長為最佳測定波長[14],然而這兩種方法均忽略食品介質(zhì)對花青素掃描結(jié)果的影響,波長選擇應(yīng)該根據(jù)具體樣品進(jìn)行優(yōu)化。另有研究選擇樣品分別在pH1.0和4.5處的最大吸收波長[13],忽略了環(huán)境pH變化會影響花青素結(jié)構(gòu)從而對掃描結(jié)果產(chǎn)生影響。本文則選擇樣品在pH為1.0和4.5環(huán)境下吸光值差值最大處為最佳吸收波長進(jìn)行方法優(yōu)化,具有更好的合理性。緩沖液稀釋桑葚酒處理液掃描后顯示在兩種緩沖液稀釋后都未在可見光區(qū)出現(xiàn)吸收峰值,且吸光值大小差異不大,這與其他研究結(jié)果有較大出入。筆者認(rèn)為出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象的原因與花色苷所處的介質(zhì)有很大關(guān)系。桑葚酒中花色苷的種類較為復(fù)雜,在發(fā)酵和后續(xù)陳釀等過程中,花色苷和一些糖代謝的中間產(chǎn)物例如丙酮酸以及乙醛等發(fā)生反應(yīng),形成許多新型的花色苷。已有研究表明在發(fā)酵過程中會形成吡喃型花青素、花色雙糖苷、聚合型花青素衍生物等結(jié)構(gòu)的花青素[24-26]。而這些花色苷因結(jié)構(gòu)不同,在顯色性能、吸收波長以及pH穩(wěn)定性等方面都有所不同。例如Vitisin B會發(fā)生較大的吸收波長的位移,吸收波長在490 nm附近,并且顏色呈橙黃色[26];Portisins型吡喃花青素具有極高的pH穩(wěn)定性,在pH為3.6和1.0的環(huán)境下仍具有相同顯色[9]。因此,由于介質(zhì)不同導(dǎo)致的種類繁多且復(fù)雜的花色苷結(jié)構(gòu)組成的樣品體系和較為簡單結(jié)構(gòu)組成的樣品體系獲得的掃描結(jié)果必定不同。這也是本文對經(jīng)過發(fā)酵酒或其他發(fā)酵處理后的飲品作為花青素介質(zhì)的樣品進(jìn)行pH示差法的測定波長條件優(yōu)化研究的意義之一。

對于反應(yīng)平衡時間的確定,不同的學(xué)者研究結(jié)果不同?；跍囟葘ㄇ嗨胤€(wěn)定性有較大影響,不同研究中反應(yīng)平衡時間確定雖多有差異,但平衡時間都不長。因此,本文確定平衡時間為40 min具有一定合理性。在pH<7.0的環(huán)境中花色苷結(jié)構(gòu)不同,化學(xué)平衡的時間不同。因此,反應(yīng)平衡時間的確定除了與溫度有關(guān)外,與花色苷的結(jié)構(gòu)密不可分。由此,不同介質(zhì)對pH示差法的測定條件有極大的影響。

然而,pH示差法測定酒中或者飲料中花青素含量是具有一定局限的,體現(xiàn)在計(jì)算中使用的消光系數(shù)ε不同。由消光系數(shù)不同引起的花青素含量測定結(jié)果與真實(shí)結(jié)果的差異可能是非常顯著的。不同的學(xué)者研究中選定的消光系數(shù)不盡相同[11-16],然而ε值不僅與選定的基準(zhǔn)花色苷有關(guān),也與樣品的基質(zhì)有關(guān),例如酸度、極性等[27]。因此為保證方法的準(zhǔn)確,不同食品基質(zhì)類型使用pH示差法時具有不同的參數(shù)和條件。

本文對桑葚酒中測定花青素含量方法的波長、緩沖液pH以及平衡溫度和時間進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)消光系數(shù)對測定結(jié)果會產(chǎn)生一定影響。最佳的條件為:在波長519 nm,緩沖液pH為1.0和4.5,于30 ℃下恒溫40 min。此時測定桑葚酒中花青素的含量為23.80 mg/L。該方法的RSD為2.076%,加標(biāo)回收率為99.59%～102.70%,表明該方法具有較高的精確性,為發(fā)酵酒類食品測定花青素含量提供一定參考。然而,為進(jìn)一步準(zhǔn)確定量分析,應(yīng)繼續(xù)根據(jù)食品介質(zhì)普遍特性確定消光系數(shù),并進(jìn)一步完善方法。