,*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅蘭州 730000; 2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,甘肅蘭州 730000)

黨參為桔梗科植物黨參(Codonopisispilosula(Franch.)Nannf.)、素花黨參(CodonopisispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L. T. Shen)或川黨參(CodonopisispilosulaOliv.)的干燥根,具有健脾益肺、養(yǎng)血生津的功效,用于脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短、津傷口渴、內(nèi)熱消渴等癥[1]。2018年國家衛(wèi)健委將黨參列入藥食同源目錄[2],其具有增強(qiáng)人體免疫功能、耐疲勞、降血壓、抗?jié)兊缺＝∽饔?可用于開發(fā)保健產(chǎn)品[3]。由于其含糖量較高,在貯藏過程中易生蟲和霉變,因此在產(chǎn)地加工中常使用硫磺熏蒸。硫熏作為一種傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工方法,在中藥材的加工和貯藏中有重要的作用,但過度硫熏嚴(yán)重影響中藥材的品質(zhì)和藥效[4-8]。近些年報(bào)道,中藥材中的SO2殘留物有神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等方面的毒性[9]。2015版藥典中收載的酸堿滴定法、氣相色譜法和離子色譜法分別作為SO2測定的第一法、第二法和第三法[1],但存在前處理繁瑣和操作復(fù)雜等問題。亞硫酸鹽可與鄰苯二甲醛溶液和乙酸銨溶液反應(yīng)生成熒光化合物1-磺酸基-異吲哚,其熒光強(qiáng)度與亞硫酸鹽的濃度成正比[10-13],根據(jù)此原理Peng等[14]建立了熒光衍生法用于檢測山藥中SO2的殘留量,此外還有熒光衍生法檢測人參及浙貝母SO2殘留量研究的報(bào)道[15-16],結(jié)果均表明熒光衍生法具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)以熒光強(qiáng)度為指標(biāo),用響應(yīng)面法對磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH及其用量、鄰苯二甲醛用量及乙酸銨濃度四個(gè)影響熒光強(qiáng)度的因素進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳熒光衍生條件,建立熒光衍生法檢測黨參SO2殘留量的方法;將黨參硫熏不同時(shí)間,并加工炮制為不同規(guī)格飲片,測定SO2殘留量,研究硫熏時(shí)間及加工炮制對黨參SO2殘留量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黨參藥材 采自甘肅省隴西縣雙泉鎮(zhèn)何家溝村,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為桔?？浦参稂h參(Codonopisispilosula(Franch.)Nannf.);蜂蜜 桂林周氏順發(fā)食品有限公司;亞硫酸鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙酸銨 上海三友試劑廠;鄰苯二甲醛 上海中秦化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鉀 西隴化工股份有限公司;無水乙醇 天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司;以上試劑 均為分析純。

Fluorolog-3穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀 HORIBA公司;元素型1860d超純水機(jī) 上海摩勒科學(xué)儀器有限公司;WB-2000型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;H1650臺(tái)式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將黨參藥材硫熏后,加工炮制為節(jié)子貨、厚片[17]、米炒[18]、蜜制[19]四個(gè)規(guī)格的飲片,晾干后用密封袋密封,置陰涼處保存,用時(shí)將樣品粉碎,取過40目篩的粉末測定二氧化硫殘留量。

1.2.1.1 硫熏黨參原藥材制備 將黨參藥材用硫磺分別熏蒸0、30、60、90 min(硫磺∶藥材=1∶150)后晾干備用。

1.2.1.2 飲片樣品制備 將硫熏黨參原藥材用少量清水悶濕后,切制成為0.2～0.4 cm的厚片和5～6 cm的節(jié)子貨,晾干;蜜制黨參:煉蜜:蜂蜜用量為25%,稱取蜂蜜于炒制容器中,武火加熱燒開后,加入蜂蜜用量三分之一的熱水,小火燒開即可;悶潤:將煉蜜加入黨參厚片,攪拌均勻,過夜,使蜂蜜被完全吸收;炒制:將炒制容器預(yù)熱后,倒入悶潤后的黨參片,文火加熱,炒制表面黃棕色,不粘手時(shí)取出放涼,即可;米炒黨參:將大米置預(yù)熱的炒制容器內(nèi),用量為黨參25%,用中火加熱炒至冒煙時(shí),投入黨參厚片拌炒,至黨參表面呈黃色,米呈焦黃時(shí),取出,篩去米,放涼。

1.2.2 供試品溶液制備 稱取硫熏黨參藥材或其飲片樣品粉末1.0 g于100 mL錐形瓶中,加入0.7%的NaOH溶液40 mL,超聲提取30 min,8000 r/min離心3 min,取上清液1.0 mL定容于25 mL容量瓶即得[15]。

1.2.3 衍生化溶液制備 參考文獻(xiàn)[14]方法,取1 μg/mL亞硫酸鈉對照品溶液或供試品溶液于10 mL容量瓶中,依次加入磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液、1 mmol/L鄰苯二甲醛溶液及乙酸銨溶液,用水定容至刻度,水浴反應(yīng)后靜置,即得衍生化溶液。

1.2.4 激發(fā)與發(fā)射波長確定 取亞硫酸鈉對照品溶液,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備衍生化溶液,用Fluorolog-3穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀掃描激發(fā)和發(fā)射波長。

1.2.5 熒光衍生條件優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn) 考察磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH與用量、鄰苯二甲醛溶液用量、乙酸銨溶液濃度與用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及靜置時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響[20-23]。

1.2.5.1 緩沖溶液pH考察 于10 mL容量瓶中加入亞硫酸鈉對照品溶液0.5 mL,分別加入pH為5.8、6.0、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液2 mL、鄰苯二甲醛溶液2 mL和5 mmoL/L的乙酸銨溶液2 mL,用蒸餾水定容，50 ℃水浴反應(yīng)5 min,冷卻后靜置50 min,檢測熒光其強(qiáng)度。

1.2.5.2 緩沖溶液用量考察 在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH為6.6,其它條件不變的情況下,考察磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL時(shí)對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5.3 鄰苯二甲醛用量考察 pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL,其它條件不變的情況下,考察鄰苯二甲醛溶液用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5.4 乙酸銨濃度考察 pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液用量2 mL,其它條件不變的情況下,考察濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mmoL/L的乙酸銨溶液對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5.5 乙酸銨用量考察 pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液用量2 mL,其它條件不變的情況下,考察5 mmol/L乙酸銨溶液用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5.6 反應(yīng)溫度對熒光強(qiáng)度的影響 pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液用量2 mL,5 mmoL/L的乙酸銨溶液用量2 mL,其它條件不變,分別考察水浴溫度為30、35、40、45、50、55、60 ℃對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5.7 反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響 pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液用量2 mL、5 mmoL/L的乙酸銨溶液用量2 mL,其它條件不變,分別考察50 ℃水浴反應(yīng)1、3、5、7、10、13、15 min對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5.8 靜置時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響 pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液2 mL,5 mmoL/L的乙酸銨溶液用量2 mL,50 ℃下水浴反應(yīng)5 min,分別考察靜置5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min對熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 為得到最佳熒光衍生條件,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,參考文獻(xiàn)[15]采用響應(yīng)面分析法研究磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH(A)及其用量(B)、鄰苯二甲醛用量(C)及乙酸銨濃度(D)四個(gè)因素對熒光強(qiáng)度的影響。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,取單因素實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果為中心,上下各取一水平作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平[24-25],用Design-Expert 10.0設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken design

1.2.7 方法學(xué)考察

1.2.7.1 線性關(guān)系及檢測限考察 精密吸取亞硫酸鈉對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL于10 mL容量瓶中,根據(jù)優(yōu)化后的衍生條件制備衍生化溶液,測定熒光強(qiáng)度,以亞硫酸鈉濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對其檢測限進(jìn)行考察(檢測限=3σ/k,σ為空白測量的標(biāo)準(zhǔn)差,k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)。

1.2.7.2 精密度試驗(yàn) 取硫熏90 min黨參樣品粉末,平行制備供試品溶液3份,衍生后連續(xù)測定6次,計(jì)算SO2殘留量RSD值。

1.2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取硫熏90 min的黨參原藥材粉末,平行制備供試品溶液6份,衍生化后檢測SO2殘留量,計(jì)算RSD值。

1.2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取硫熏90 min的黨參原藥材粉末,按“1.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液3份,分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h測定熒光強(qiáng)度,計(jì)算SO2殘留量RSD值。

1.2.7.5 加樣回收試驗(yàn) 稱取硫熏30 min的黨參原藥材(編號1、2、3)與米炒(編號4、5、6)、蜜制(編號7、8、9)飲片粉末各3份,分別加入濃度為120 μg/mL的亞硫酸鈉對照品溶液0.8、1.0與1.2 mL,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品,衍生后測熒光強(qiáng)度,計(jì)算回收率。

1.2.8 樣品測定 取硫熏黨參原藥材及其飲片樣品粉末,按“1.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液,衍生后測定熒光強(qiáng)度,計(jì)算SO2殘留量。酸堿滴定法測定方法參照《中國藥典》2015版第四部通則目次“2331項(xiàng)”二氧化硫檢測方法[1]檢測SO2殘留量。其中熒光衍生法測得最終結(jié)果為亞硫酸鈉的含量,將亞硫酸鈉折算為SO2,計(jì)算公式:

試中:c為供試品溶液衍生化后測得的亞硫酸鈉濃度,μg/mL;10為溶液體積，mL;1000為供試品稀釋倍數(shù);0.5075為每g亞硫酸鈉相當(dāng)?shù)腟O2的質(zhì)量;m為供試品的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)發(fā)射波長

激發(fā)與發(fā)射波長掃描結(jié)果見圖1,激發(fā)波長(λEx)為320 nm,發(fā)射波長(λEm)為385 nm,最終確定測定衍生溶液熒光強(qiáng)度的條件為λEx/λEm=320/385。

圖1 激發(fā)發(fā)射圖譜Fig.1 Excitation and emission spectrum

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 緩沖溶液pH對熒光強(qiáng)度的影響 由圖2可知,隨磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH的增大,熒光強(qiáng)度先增大后減小,pH為6.6時(shí)熒光強(qiáng)度為681755.24,此時(shí)熒光強(qiáng)度最大。根據(jù)方差分析結(jié)果可得pH6.6與pH6.5、6.7對熒光強(qiáng)度的影響有顯著性差異(P<0.05),因此選擇磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液最佳pH為6.6。

圖2 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH對熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH of disodium hydrogen phosphate-potassiumdihydrogen buffer solution on the fluorescence intensity注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05);圖3～9同。

2.2.2 緩沖溶液用量對熒光強(qiáng)度的影響 由圖3可知,隨磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量的增加,熒光強(qiáng)度先增大后減小,磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量為1.5 mL時(shí),熒光強(qiáng)度最大,為674537.77。根據(jù)方差分析結(jié)果,磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量1.5 mL與用量1.0和2.0 mL對熒光強(qiáng)度的影響有顯著差異(P<0.05),因此選擇磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液最適用量為1.5 mL。

圖3 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量對熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of dosage of disodium hydrogenphosphate-potassium dihydrogen buffersolution on the fluorescence intensity

2.2.3 鄰苯二甲醛用量對熒光強(qiáng)度的影響 由圖4可得,隨鄰苯二甲醛用量的增加,熒光強(qiáng)度先增大后減小,當(dāng)鄰苯二甲醛溶液用量為2.0 mL時(shí),熒光強(qiáng)度最大,為589218.52。鄰苯二甲醛溶液用量2.0 mL與用量1.5和2.5 mL對熒光強(qiáng)度的影響有顯著差異(P<0.05),因此選擇鄰苯二甲醛最適用量為2.0 mL。

圖4 鄰苯二甲醛用量對熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of dosage of o-phthalaldehydesolution on the fluorescence intensity

2.2.4 乙酸銨濃度對熒光強(qiáng)度的影響 由圖5可知,隨乙酸銨濃度的增大,熒光強(qiáng)度先增大后減小,當(dāng)乙酸銨濃度為5 mmol/L時(shí),熒光強(qiáng)度最大,為776035.51。乙酸銨濃度為5 mmol/L與濃度為2.5和7.5 mmol/L對熒光強(qiáng)度的影響有顯著性差異(P<0.05),因此選擇乙酸銨最適濃度為5 mmol/L。

圖5 乙酸銨濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of ammonium acetate concentrationon the fluorescence intensity

2.2.5 乙酸銨用量對熒光強(qiáng)度的影響 由圖6可知,隨乙酸銨用量的增加,熒光強(qiáng)度先增大后減小,當(dāng)乙酸銨用量為2.0 mL時(shí),熒光強(qiáng)度最大,為616380.16,。根據(jù)方差分析,乙酸銨用量2.0、1.5 mL對熒光強(qiáng)度的影響無顯著差異(P>0.05),根據(jù)熒光強(qiáng)度測定結(jié)果最終選擇乙酸銨用量為2.0 mL。

圖6 乙酸銨用量對熒光強(qiáng)度的影響 Fig.6 Effect of ammonium acetate dosageon the fluorescence intensity

2.2.6 反應(yīng)溫度對熒光強(qiáng)度的影響 由圖7可知,隨反應(yīng)溫度的升高,熒光強(qiáng)度先增大后減小,當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí),熒光強(qiáng)度最大,為768253.66。根據(jù)方差分析,反應(yīng)溫度為50 ℃與45、55 ℃時(shí)的熒光強(qiáng)度之間無顯著性差異(P>0.05),根據(jù)熒光強(qiáng)度測定結(jié)果選擇反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖7 反應(yīng)溫度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of reaction temperatureon the fluorescence intensity

2.2.7 反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響 由圖8可知,隨反應(yīng)時(shí)間延長,熒光強(qiáng)度先增大后減小,反應(yīng)時(shí)間為5 min時(shí),熒光強(qiáng)度最大,為748425.61。反應(yīng)5 min與反應(yīng)3、7 min時(shí)的熒光強(qiáng)度之間無顯著性差異(P>0.05),根據(jù)熒光強(qiáng)度測定結(jié)果選擇反應(yīng)時(shí)間為5 min。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of reaction timeon the fluorescence intensity

2.2.8 靜置時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響 由圖9可知,隨靜置時(shí)間的增長,熒光強(qiáng)度逐漸降低,在40～120 min之間其熒光強(qiáng)度降低了4.28%,變化較小。根據(jù)方差分析,靜置40、50 min時(shí)熒光強(qiáng)度之間無顯著性差異(P>0.05),從時(shí)間角度考慮選擇靜置時(shí)間為40 min。

圖9 靜置時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響Fig.9 Effect of static reaction timeon the fluorescence intensity

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2,用Design-Expert 10.0對結(jié)果分析,方差分析見表3,由表3可知回歸模型極顯著(P<0.01),表明該回歸模型有意義;模型R2=0.9691,說明該模型可解釋絕大部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),失擬項(xiàng)P>0.05,無顯著差異,表明擬合度良好。從表3中可知,模型中一次項(xiàng)A不顯著(P>0.05),B、D極顯著(P<0.01),C顯著(P<0.05),二次項(xiàng)中A2、B2、C2均極顯著(P<0.01),D2不顯著(P>0.05),交互作用均不顯著(P>0.05)。得到磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH(A)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量(B)、鄰苯二甲醛溶液用量(C)及乙酸銨濃度(D)與反應(yīng)體系熒光之間的回歸方程為:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

R1=8.877E+005+4384.21A+15628.02B+12710.29C-70302.88D-10836.69AB+4293.95AC-5984.64AD-1310.17BC+2241.47BD-14992.68CD-69171.06A2-63970.07B2-49685.91C2-11443.15D2。

2.3.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面的坡度越大,表明因素對響應(yīng)值的影響越大;響應(yīng)面坡度越小,表明因素改變對響應(yīng)值的影響也越小[26]。磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液pH及用量、鄰苯二甲醛溶液用量及乙酸銨溶液濃度對熒光強(qiáng)度的影響如圖10所示,結(jié)合方差分析結(jié)果可知,四個(gè)因素之間的交互作用均不顯著。

圖10 各因素相互作用對熒光強(qiáng)度影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plots of interaction of factors affecting the fluorescence intensity

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果 根據(jù)Design Expert 10.0軟件預(yù)測的最佳結(jié)果,確定最佳衍生條件為:pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量為1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液用量為2.1 mL,2.5 mmol/L乙酸銨用量2.0 mL,反應(yīng)溫度為50 ℃,反應(yīng)時(shí)間為5 min,靜置時(shí)間為40 min,預(yù)測結(jié)果為951516.78。根據(jù)最佳衍生條件對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)際測得平均熒光強(qiáng)度為955865.21,經(jīng)方差分析,預(yù)測結(jié)果與實(shí)際測得結(jié)果無顯著差異(P>0.05),誤差為0.46%。因此,用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化熒光衍生法的結(jié)果可靠。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 以亞硫酸鈉濃度與熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得方程Y=1.37064E7X+288776,R2=0.9991,表明亞硫酸鈉濃度在0.01～0.2 μg/mL之間線性關(guān)系良好,見圖11,檢測限為1.89×10-3μg/mL。

圖11 亞硫酸鈉線性關(guān)系Fig.11 Standard curve of sodium sulfite

2.4.2 精密度試驗(yàn) 熒光強(qiáng)度RSD為0.76%,表明儀器精密度良好,結(jié)果見表4。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 二氧化硫殘留量RSD為1.59%,說明該方法重復(fù)性良好,結(jié)果見表5。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在3 h內(nèi)熒光強(qiáng)度RSD為4.13%,在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 6 Stability test results of experimental methods

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 平均回收率為98.61%,回收率RSD為4.89%,表明該方法回收率較好,結(jié)果見表7。

表7 加樣回收考察結(jié)果Table 7 Addition standard recycling inspection results

圖12 專屬性考察結(jié)果Fig.12 Results of specificity inspection

2.5 樣品測定結(jié)果與分析

2.5.1 不同硫熏時(shí)間對黨參藥材SO2殘留量的影響 藥典規(guī)定黨參藥材及飲片SO2殘留量不得超過400 μg/g[27],圖13～圖16中熒光衍生法測定結(jié)果顯示:硫熏0、30 min原藥材SO2殘留量未超出藥典規(guī)定的400 μg/g的標(biāo)準(zhǔn),而硫熏60、90 min原藥材SO2殘留量均超出藥典規(guī)定的400 μg/g的標(biāo)準(zhǔn)。其中,硫熏0 min原藥材也檢測出SO2殘留,但含量較低,可能有以下兩個(gè)因素:一是在黨參生長過程中從自然界中吸收的少量SO2,二是在貯藏過程中被污染而有SO2殘留。SO2可以殺死蟲卵,其與水結(jié)合后產(chǎn)生的亞硫酸可以抑制細(xì)菌滋生;黨參樣品在貯存兩個(gè)月時(shí),硫熏0、30、60 min原藥材均出現(xiàn)發(fā)霉現(xiàn)象,貯存六個(gè)月后硫熏0、30 min原藥材生蟲現(xiàn)象嚴(yán)重,硫熏60 min原藥材生蟲現(xiàn)象較輕,而硫熏90 min原藥材在貯存1年內(nèi)未出現(xiàn)生蟲和發(fā)霉現(xiàn)象。雖然黨參硫熏90 min可以防止生蟲發(fā)霉,但SO2殘留量超出藥典標(biāo)準(zhǔn),影響用藥安全。黨參的產(chǎn)地加工中應(yīng)盡量避免硫磺熏蒸,近些年有文獻(xiàn)報(bào)道了熱風(fēng)干燥、紅外干燥、微波干燥[28-30]等取代硫熏的加工方法,可以起到防蟲、防霉的作用,為替代黨參硫熏提供新的發(fā)展思路。

圖13 硫熏0 min樣品二氧化硫殘留量變化Fig.13 Change of sulfur dioxide residualin sulfur fumigation sample for 0 min注:顯著性在相同測定方法結(jié)果內(nèi)比較,不同字母表示差異顯著,P<0.05;圖14～16同。

圖14 硫熏30 min樣品二氧化硫殘留量變化Fig.14 Change of sulfur dioxide residualin sulfur fumigation sample for 30 min

圖15 硫熏60 min樣品二氧化硫殘留量變化Fig.15 Change of sulfur dioxide residualin sulfur fumigation sample for 60 min

圖16 硫熏90 min樣品二氧化硫殘留量變化Fig.16 Change of sulfur dioxide residualin sulfur fumigation sample for 90 min

2.5.2 加工炮制對黨參SO2殘留量的影響 黨參經(jīng)加工炮制為飲片(節(jié)子貨、厚片、米炒和蜜制)后,SO2殘留量測定結(jié)果見圖13～圖16,熒光衍生法測定結(jié)果顯示:原藥材與飲片之間SO2殘留量均有顯著差異(P<0.05),蜜制飲片與其它樣品SO2殘留量也均有顯著差異(P<0.05),說明硫熏黨參經(jīng)加工炮制后,飲片較原藥材SO2殘留量明顯降低,而蜜制飲片的SO2殘留量最低;其中硫熏0、30、60 min飲片與硫熏90 min蜜制飲片SO2殘留量符合藥典標(biāo)準(zhǔn),硫熏90 min節(jié)子貨、厚片及米炒飲片SO2殘留量均超出藥典標(biāo)準(zhǔn);與原藥材相比節(jié)子貨SO2殘留量平均降低49.75%,厚片SO2殘留量平均降低約42.73%,米炒后SO2殘留量平均降低50.2%,蜜制后SO2殘留量平均降低61.08%,可能是在樣品處理過程中用水將黨參悶濕后,再進(jìn)行切片的過程中SO2殘留量降低較大,其次米炒與蜜制飲片較厚片SO2殘留量低,可能是因?yàn)樵诔粗七^程中,高溫加熱使部分SO2揮發(fā),且高溫使SO2與黨參成分發(fā)生反應(yīng),轉(zhuǎn)化為含硫衍生物[31-32],從而使SO2殘留量殘留量降低。

2.5.3 熒光衍生法與酸堿滴定法結(jié)果比較 熒光衍生法測得結(jié)果較酸堿滴定法測得結(jié)果平均高24.87%,因?yàn)樗釅A滴定法在酸性條件下測得的SO2留量僅為游離態(tài)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化為SO2的量,而可逆結(jié)合態(tài)的亞硫酸鹽在酸性條件下穩(wěn)定;而熒光衍生法采用NaOH溶液提取,可將可逆結(jié)合態(tài)的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化為游離的亞硫酸鹽[33],其測得結(jié)果要比酸堿滴定法測得結(jié)果略高。

3 結(jié)論

本文用響應(yīng)面法對熒光衍生法的衍生條件進(jìn)行優(yōu)化,建立回歸模型,經(jīng)方差分析證明該模型可靠,根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果確定最佳熒光衍生件為:pH為6.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液用量為1.5 mL,鄰苯二甲醛溶液用量為2.1 mL,2.5 mmol/L乙酸銨用量2.0 mL,反應(yīng)溫度為50 ℃,反應(yīng)時(shí)間為5 min,靜置時(shí)間為40 min,在此條件下測得平均熒光強(qiáng)度為955865.21;方法學(xué)考察結(jié)果顯示:亞硫酸鈉濃度在0.01～0.2 μg/mL之間,熒光強(qiáng)度有較好的線性關(guān)系,檢測限為1.89×10-3μg/mL,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收及專屬性考察結(jié)果較好;熒光衍生法可作為黨參SO2殘留量的測定方法,其測得結(jié)果與酸堿滴定法測定結(jié)果相比平均高24.87%。

黨參硫熏0、30 min原藥材SO2殘留量未超出藥典標(biāo)準(zhǔn),而硫熏60、90 min原藥材SO2殘留量超出藥典標(biāo)準(zhǔn);加工炮制可以降低硫熏黨參的SO2殘留量,硫熏黨參經(jīng)加工炮制后,飲片較原藥材SO2殘留量均明顯降低,蜜制飲片SO2殘留量最低;硫熏0、30、60 min飲片與硫熏90 min蜜制飲片SO2殘留量符合藥典標(biāo)準(zhǔn),硫熏90 min節(jié)子貨、厚片及米炒飲片SO2殘留量均超出藥典標(biāo)準(zhǔn)。