(肇慶學院食品與制藥工程學院,廣東肇慶 526061)

鳳凰單樅是我國特有的歷史傳統(tǒng)名茶,產自廣東省潮州市鳳凰山,由鳳凰水仙種中的優(yōu)異品系單獨采摘加工而成[1]。鳳凰單樅屬烏龍茶類,其栽種歷史悠長,品種資源豐富,成茶品質優(yōu)異,具有“形美、味甘、色翠、香郁”的特點[2-3],深受消費者的喜愛。大量研究表明,長期飲茶可以預防癌癥[4]、糖尿病[5]、心血管疾病[6]、肥胖[7]、骨質疏松[8]等慢性疾病,主要在于茶中富含多酚類化合物[9-10]。

茶多酚主要包括兒茶素類、黃酮類、花青素類和酚酸類物質,具有抗癌、抗氧化、防輻射、防止動脈硬化、提神解乏、護齒明目等功效,并可作為天然的防腐劑和抗氧化劑輔助應用于果蔬、肉制品、乳制品、油脂及糕點類食品等的保鮮及貯藏[11-12]。目前,針對綠茶、紅茶中活性成分提取及其抗氧化活性的研究已有廣泛報道,也有學者對單樅茶葉的葉片特征[2]、香氣成分[3]等進行了研究。近年來,超聲波提取技術被廣泛應用于植物多酚、黃酮、多糖、氨基酸等天然活性成分的提取。基于超聲波的熱效應、機械作用和空穴作用,能夠加快胞內物質有效溶出,避免長時間高溫下活性物質的損失,減少溶劑的使用,實現(xiàn)對目標物環(huán)保、高效的提取[13]。

目前,有關鳳凰單樅茶中活性成分提取及其功效評價方面的研究工作仍未開展,因此,本研究對鳳凰單樅茶多酚的提取工藝條件進行優(yōu)化,并對多酚提取物的體外抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究,為鳳凰單樅價值的充分利用和資源的進一步推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳳凰單樅(蜜蘭香型) 購自潮州鳳凰鎮(zhèn);蘆丁標準品 北京市百靈威科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、阿卡波糖 上海阿拉丁試劑公司;福林酚、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡糖苷(PNPG) 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、無水碳酸鈉、沒食子酸、過氧化氫、維生素C、水楊酸等 均為國產分析純。

DHG-9145A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;HHS-21-6數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;722S可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;Q-400B固體樣品粉碎機 上海冰都電器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳳凰單樅茶多酚提取工藝 將鳳凰單樅茶于45 ℃烘干至恒重,粉碎后過60目篩,避光密封保存?zhèn)溆?。準確稱取一定量的鳳凰單樅茶粉末樣品,按一定液料比在實驗設定的溫度下超聲功率300 W提取一定時間,將粗提液減壓抽濾,所得殘渣在相同條件下重復提取1次,合并兩次提取的濾液,用乙醇定容至100 mL,得鳳凰單樅茶多酚提取液。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響 在液料比40∶1,溫度60 ℃條件下,按1.2.1中提取流程,分別利用體積分數(shù)為60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇超聲提取30 min,考察乙醇濃度對鳳凰單樅多酚得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對多酚得率的影響 以70%的乙醇為提取劑,在液料比40∶1條件下,按1.2.1中提取流程,控制溫度為30、40、50、60、70、80 ℃,分別超聲提取30 min,考察溫度對鳳凰單樅多酚得率的影響。

1.2.2.3 超聲提取時間對多酚得率的影響 以70%的乙醇為提取劑,在液料比40∶1、溫度60 ℃條件下,按1.2.1中提取流程,分別超聲提取20、30、40、50、60、70 min,考察超聲提取時間對鳳凰單樅多酚得率的影響。

1.2.2.4 液料比對多酚得率的影響 以70%的乙醇為提取劑,在溫度60 ℃條件下,按1.2.1中提取流程,控制液料比為25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1,分別超聲提取30 min,考察液料比對鳳凰單樅多酚得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,利用Design-Expert 8.0.6軟件對所考察的四個單因素進行Box-Behnken實驗設計,優(yōu)化鳳凰單樅茶多酚的提取工藝,響應面實驗因素及編碼值見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 多酚含量的測定

1.2.4.1 標準曲線的繪制 按照李卓瓦等[14]繪制標準曲線的方法,稍作修改。配制質量濃度為1 mg/mL沒食子酸標準溶液,分別量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述標準液于100 mL容量瓶中,定容后得到沒食子酸梯度標準液。量取梯度標準液各1 mL,分別加入5 mL福林-酚試劑,充分混勻,靜置5 min,依次加入4 mL 10%的飽和碳酸鈉稀釋液,混勻后置于室溫下反應2 h。以去離子水替代沒食子酸溶液作為空白對照,測定反應后的各溶液在765 nm處的吸光度值,每組重復測定3次。以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程y=0.0142x+0.00317(R2=0.9991),在所選質量濃度范圍內線性關系良好。

1.2.4.2 鳳凰單樅茶多酚得率計算 參照上述標準曲線的實驗步驟測定鳳凰單樅茶多酚含量,其得率計算公式如下:

式(1)

式中:C為鳳凰單樅提取液茶多酚的質量濃度/(μg/mL);V為多酚提取液的體積/mL;N為稀釋倍數(shù);m為鳳凰單樅的質量/mg。

1.2.5 鳳凰單樅茶多酚抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 依據(jù)參考文獻[15],取1.0 mL鳳凰單樅茶多酚提取液,加入0.1 mmol/L DPPH 3.0 mL,室溫充分搖勻,避光靜置反應30 min,于517 nm處測定樣品的吸光度A1,用等體積的無水乙醇代替DPPH溶液測得517 nm處的吸光度為A2,用等體積的無水乙醇代替樣品溶液測得517 nm處的吸光度為A0。以VC為陽性對照,每組樣品平行測定3次,計算相應均值和清除率。清除率計算公式如下:

式(2)

1.2.5.2 羥自由基清除能力 將濃縮后的樣品配制成0.20、0.22、0.24、0.26、0.28 mg/mL濃度梯度的溶液。依據(jù)參考文獻[16],取2.0 mL鳳凰單樅茶多酚提取液于20 mL試管中,再依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL,混合均勻放置10 min,再加入6 mmol/L水楊酸2.0 mL,搖勻后于37 ℃恒溫水浴反應30 min,以無水乙醇作參比溶液,于波長510 nm處測定其吸光度為A1;用無水乙醇取代水楊酸溶液,測定其吸光度為A2;再以無水乙醇代替樣品溶液測其吸光度為A0。以蒸餾水作參比溶液,以VC為陽性對照,每組樣品平行測定3次,代入公式(2)計算相應清除率。

1.2.6 鳳凰單樅茶多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的測定 參照Yang等[17]的方法測定鳳凰單樅茶多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。利用0.2 mol/L的PBS緩沖液(pH6.8)配制α-葡萄糖苷酶液(0.5 U/mL)和PNPG溶液(3.0 mmol/L)。取50 μL不同濃度的鳳凰單樅茶多酚提取物,分別加入20 μLα-葡萄糖苷酶溶液,混勻,37 ℃恒溫孵育15 min,再加入50 μL PNPG溶液,于37 ℃恒溫反應15 min,加入70 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,于405 nm波長處測得吸光度為A1。用緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液,測其吸光度為A2;以緩沖溶液代替樣品溶液測其吸光度為A0,以阿卡波糖為陽性對照,每組樣品平行測定3次,利用公式(2)計算α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復3次,結果以均值±標準差表示。采用Excel 2011、SPSS 19.0和Design-Expert V 8.0.6對數(shù)據(jù)進行整理、分析并繪圖,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響 由圖1可知,鳳凰單樅多酚得率隨乙醇體積分數(shù)的增加呈先增大后減小的趨勢,當乙醇體積分數(shù)為70%時,得率達最大值18.15%。原因可能在于乙醇體積分數(shù)較低時,一些水溶性物質的溶出影響多酚的溶出;隨著乙醇體積分數(shù)的增加,提取液極性與多酚極性接近,多酚得率增加;當乙醇體積分數(shù)過高時,提取溶劑極性減小,導致部分多酚不能溶出,部分脂溶性組分的溶出也不利于多酚的充分提取[18-19]。因此,乙醇體積分數(shù)選擇為70%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrationon the extraction yield of polyphenols

2.1.2 提取溫度對多酚得率的影響 如圖2所示,在30～60 ℃范圍內,多酚的得率隨著超聲提取溫度的升高明顯增加,在60 ℃時達到最大值18.14%,隨后逐漸減小。原因在于,一定溫度范圍內,分子熱運動使得多酚類物質的溶解速度和溶解量隨著溫度的升高而增加;而多酚是一類多羥基物質,熱穩(wěn)定性差,當溫度繼續(xù)升高超過60 ℃時,易被氧化從而破壞了其結構的完整性[20],導致多酚得率下降。因此,提取溫度選擇為60 ℃。

圖2 提取溫度對多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperatureon the yield of polyphenols

2.1.3 提取時間對多酚得率影響 由圖3可知,當超聲提取時間在20～30 min范圍內,由于超聲波空化效應的影響,分子運動頻率增加、速度加快,溶劑的滲透力增強,以及超聲波對細胞的機械振動粉碎作用,使細胞得到快速有效地破碎[13],從而提高了茶多酚溶出效率和溶出量。當超聲處理時間為30 min時,茶多酚的得率達到最大值18.12%。此后,隨著超聲提取時間的延長,多酚得率逐漸下降,可能由于超聲振動時間過長對多酚的結構造成破壞[21],導致得率下降。因此,超聲提取鳳凰單樅茶多酚的適宜時間為30 min左右。

圖3 提取時間對多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction timeon the yield of polyphenols

2.1.4 液料比對多酚得率影響 由圖4可知,液料比為25∶1～40∶1時,隨著提取溶劑用量的增大,多酚的得率增加,原因在于提高液料比可在一定程度上增大細胞膜內外物質的濃度差,促進多酚的溶出。當液料比達到40∶1時,多酚得率為18.08%;之后,隨著提取溶劑用量的增大,茶多酚的得率呈下降趨勢,可能由于在此過程中有色素、多糖等其他雜質的溶出,從而影響茶多酚的提取效果,導致其得率下降[22]。因此,液料比選擇為40∶1。

圖4 液料比對多酚得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratioon the extraction yield of polyphenols

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 模型建立及方差分析 利用Design-Expert V 8.0.6對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,以多酚得率為因變量,乙醇體積分數(shù)、提取溫度、超聲提取時間、液料比為自變量,建立回歸方程:Y=-102.69+2.001A+0.573B+0.244C+1.473D+3.4×10-3AB-2.1×10-3AC+8.5×10-3AD+3.75×10-4BC-3×10-3BD+9×10-4CD-0.018A2-6.106×10-3B2-2.306×10-3C2-0.023D2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the regression model

2.2.2 交互作用分析 響應面圖的陡峭程度和形狀可以直觀體現(xiàn)各因素間的聯(lián)系及交互作用情況。如圖5所示,為乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、液料比間的交互作用的響應面圖和等高線圖。

圖5 各因素交互作用對多酚得率的影響Fig.5 Effects of interaction among factors on the yield of polyphenols

由圖5可知,乙醇體積分數(shù)和提取溫度、乙醇體積分數(shù)和液料比、提取溫度和液料比的交互作用坡面圖形狀陡峭,且等高線形狀均趨于橢圓,說明各因素兩兩間交互作用顯著。乙醇體積分數(shù)和提取時間、提取溫度和提取時間、提取時間和液料比或響應面圖坡面相對平緩,或等高線形狀趨于圓形,表明以上各因素間交互作用不顯著。

2.2.3 模型的驗證 由響應面分析確定鳳凰單樅茶多酚提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)69.25%、提取溫度56.84 ℃、提取時間34.24 min、液料比42.30∶1，在此條件下茶多酚得率最高達18.22%?？紤]到實際提取的可操作性,將預測的最適工藝條件修正為:乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度57 ℃、提取時間34 min、液料比42∶1 (mL/g)。經3次提取實驗驗證,得到茶多酚得率的均值為18.18%±0.23%,與預測值相差較小,表明模型可靠,優(yōu)化所得工藝條件可用于鳳凰單樅多酚的有效提取。

2.3 鳳凰單縱多酚的抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 由圖6可知,鳳凰單樅多酚具有較好的清除DPPH·的能力,其半抑制濃度IC50為8.42 μg/mL,清除率大小與多酚質量濃度呈一定量效關系,且整體清除能力優(yōu)于VC。當鳳凰單樅多酚質量濃度在5～20 μg/mL范圍內,對DPPH·的清除率隨著質量濃度的增加而快速增大;當鳳凰單樅多酚質量濃度在20～60 μg/mL范圍時,對DPPH·的清除率增加趨于平緩。VC對DPPH·的清除能力隨著其質量濃度的增大而逐漸增強,其半抑制濃度IC50為10.38 μg/mL,清除能力低于鳳凰單樅多酚;當質量濃度大于40 μg/mL時,其對DPPH·的清除能力(清除率94.0%±1.6%)與鳳凰單樅多酚(清除率96.6%±2.2%)逐漸接近。

圖6 鳳凰單樅多酚對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging effect ofpolyphenols from Phoenix Dan Cong

2.3.2 羥基自由基清除能力的測定 由圖7可知,鳳凰單樅多酚具有較強的清除·OH的能力,在實驗測定的質量濃度范圍內,其清除能力與多酚質量濃度呈一定量效關系,半抑制濃度IC50為24.70 μg/mL。隨著質量濃度的增加,鳳凰單樅多酚對·OH的清除率持續(xù)增大,且高于VC對OH·的清除率。其原因可能在于,鳳凰單樅中含豐富的兒茶素單體和多聚體,可提供較多的酚羥基,使其對·OH的的清除能力明顯高于VC。當質量濃度達60 μg/mL時,兩者對·OH的清除能力相當。

圖7 鳳凰單樅多酚對羥基自由基的清除作用Fig.7 OH radical-scavenging effect ofpolyphenols from Phoenix Dan Cong

2.4 鳳凰單縱多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性分析

由圖8可知,鳳凰單樅多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性具有明顯的抑制作用,隨著多酚質量濃度的增大,其抑制作用不斷增強,半抑制濃度IC50為7.24 μg/mL。當鳳凰單樅多酚質量濃度達20 μg/mL時,α-葡萄糖苷酶的活性幾乎完全被抑制,且鳳凰單樅多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用整體顯著(P<0.05)高于阿卡波糖(IC50為24.55 μg/mL)。該實驗結果與Koh等[23]報道的結果相吻合,原因可能在于,鳳凰單樅中的茶黃素對α-葡萄糖苷酶活性起主要抑制作用。當質量濃度達60 μg/mL以上時,鳳凰單樅多酚提取物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用逐漸趨近。

圖8 鳳凰單樅多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.8 Inhibition effect of polyphenolsfrom Phoenix Dan Cong on α-glucosidase activity

3 結論

利用超聲輔助提取鳳凰單樅茶多酚,經單因素實驗和響應面分析優(yōu)化確定鳳凰單樅多酚提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度57 ℃、提取時間34 min、液料比42∶1 mL/g,該條件下多酚得率達18.18%±0.23%,明顯高于茯磚黑茶(多酚提取率5.21%)[24]和白茶(多酚提取率5.65%)[25],表明優(yōu)化所得工藝條件可有效提取鳳凰單樅多酚,具有良好的開發(fā)應用前景。抗氧化研究表明,提取所得鳳凰單樅多酚對DPPH·和·OH具有較高的清除率,清除能力與其質量濃度呈一定量效關系,其IC50分別為8.42和24.70 μg/mL。在相同質量濃度下,鳳凰單樅多酚的IC50均低于對照組VC,表明其抗氧化能力優(yōu)于VC。抑制α-葡萄糖苷酶活性分析研究表明,鳳凰單樅多酚對α-葡萄糖苷酶活性具有顯著的抑制作用,IC50為7.24 μg/mL,抑制效果優(yōu)于對照組阿卡波糖,表明其在餐后血糖控制方面有較好的應用前景。該研究彌補了鳳凰單樅多酚提取及體外抗氧化、降糖研究的部分空白,為鳳凰單樅資源的充分利用和保健功能的推廣提供了參考依據(jù)。