,+,2,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物多樣性應用技術(shù)國家工程研究中心,云南昆明 650201; 2.云南省滇臺特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心,云南昆明 650201)

釀酒葡萄在接近成熟期時感染灰葡萄孢可發(fā)生貴腐作用,以貴腐葡萄為原料可釀制貴腐葡萄酒,貴腐葡萄酒(Botrytized wines)因其獨特的風味而具有較高的產(chǎn)品附加值。世界知名的自然貴腐葡萄酒有匈牙利托卡伊(Tokaji)產(chǎn)區(qū)的奧蘇(Aszú),法國波爾多(Bordeaux)產(chǎn)區(qū)的蘇玳(Sauternes)等[1],其中匈牙利是貴腐葡萄酒的起源地[2-3]。貴腐作用對葡萄酒風味物質(zhì)的影響比較復雜,它們的風味通常有一個非常突出的變化過程,在年輕的酒中貢獻主要是柑橘和干果風味,陳釀的酒則呈現(xiàn)出橘皮的風味[4]?；移咸焰?B.cinerea)的活性使得經(jīng)過貴腐作用的漿果成分發(fā)生變化,比如果皮細胞退化,葡萄糖的氧化降解,甘油的產(chǎn)生,葡萄糖酸、半乳糖醛酸等物質(zhì)含量增加,酒石酸含量降低,貴腐香氣形成等[5-6]。

釀酒葡萄感染灰葡萄孢的氣候條件一般為20 ℃左右的溫度,75%以上的相對濕度[5],自然條件下一般表現(xiàn)為早晨多霧潮濕,下午陽光燦爛,但這種條件很難持續(xù),即便是世界上著名的葡萄酒產(chǎn)區(qū)也只有個別年份會發(fā)生,例如法國的蘇玳產(chǎn)區(qū)(Sauternes)、匈牙利的托卡伊(Tokaji)以及德國的萊茵產(chǎn)區(qū)等。由于在自然情況下很難得到滿足貴腐酒生產(chǎn)的葡萄,所以人們開始研究人工接種貴腐菌來釀造貴腐酒。Tosi等[7]將灰葡萄孢菌的孢子懸浮液噴灑到新采摘的葡萄表面,探究人工接種貴腐菌對葡萄酒風味的影響,結(jié)果表明灰霉病菌對葡萄的侵染程度以及葡萄的萎焉程度對葡萄酒的揮發(fā)成分影響很大。Negri等[8]研究了在葡萄采摘后誘導貴腐菌侵染是否可以提高葡萄酒的品質(zhì),所得結(jié)論為侵染貴腐菌和未侵染的葡萄漿果具有顯著的代謝差異,貴腐菌影響了葡萄漿果的代謝和組成。金其榮等[5,9]探究了人工貴腐菌的分離與接種方法以及人工貴腐酒的釀造工藝;陶永勝等[10]研究了釀酒葡萄經(jīng)人工侵染灰葡萄孢后所釀貴腐酒的香氣特征;蘭圓圓[11]對人工貴腐酒的釀造工藝進行了研究。

云南省具有地理氣候適宜和生物資源多樣性條件,作為一個傳統(tǒng)的葡萄酒產(chǎn)區(qū),也鮮有適合貴腐酒釀造條件的葡萄園,且關(guān)于貴腐酒的生產(chǎn)釀造也未見有報道。本研究從感染灰霉病的夏黑葡萄果實上分離灰葡萄孢,以人工噴灑灰葡萄孢子接種的玫瑰蜜葡萄為原料釀造人工貴腐葡萄酒,并以未接種灰葡萄孢的葡萄酒為對照,通過香氣成分和香氣特征的比較分析,評價人工貴腐玫瑰蜜葡萄酒的香氣特征及其工藝技術(shù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒葡萄原料 選取種植于云南農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)教育科研基地的釀酒葡萄品種玫瑰蜜,采摘成熟的葡萄果實進行釀酒試驗;貴腐菌株 為灰葡萄孢菌株,該菌株于2017從云南農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)教育科研基地葡萄種植園的夏黑葡萄果實染病組織上分離得到,經(jīng)形態(tài)學和分子鑒定為灰葡萄孢(Botrytiscinerea)[12];2-辛醇、液體石蠟、碘、酒石酸、氫氧化鈉、碘化鉀、淀粉、無水乙醇、硫酸、磷酸二氫鉀、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、鹽酸、酚酞 均為分析純,成都科龍試劑廠;釀酒酵母(帝伯仕釀酒酵母RC212) 帝伯士啤酒有限公司;真菌基因組DNA快速抽提試劑盒 Sigma,美國;擴增rDNA-ITS 的通用引物:ITS1(AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG);ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) 由Takara公司合成;PDA培養(yǎng)基:200 g土豆,20 g葡萄糖,15 g瓊脂,1000 mL水;BC培養(yǎng)基(1/2PDA培養(yǎng)基+1/2MEA培養(yǎng)基);50%土豆汁、1% 葡萄糖、2% 瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司;0.3%大豆蛋白胨、3%麥芽汁膏、2%瓊脂 均為北京凱瑞基生物科技有限公司;所用無機溶劑和有機溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

布魯克氣相色譜儀(型號SCION SQ 456-GC) 美國布魯克公司;DB-WAX色譜柱 上海熹垣生物科技有限公司,30 m×0.25 mm×0.25 μm;75 μm CAR/PDMS萃取頭 廣州海恩醫(yī)療科技有限公司;光學顯微鏡 上海連橋生物科技有限公司;紫外分光光度計 日本Shimadzu 公司;人工氣候箱(Blue pard) 諾丁科學器材有限公司;pHMT-1型pH計 瑞士梅特勒儀器公司;AUY 200分析天平 精確度萬分之一,日本島津公司;SX-500 高壓滅菌鍋 日本TOMY公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺 中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;其他均為實驗室常用儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰葡萄孢的分離、純化及保存 運用常規(guī)組織分離法,選取感染灰霉病的葡萄果實,先用自來水沖洗干凈,再用0.1%的升汞對其表面消毒1 min,然后用無菌水沖洗2～3次,再用滅過菌的手術(shù)刀切取約2 mm×4 mm大小的病健交接組織,用滅菌的鑷子夾取剪好的組織置于PDA培養(yǎng)基上,輕輕按壓,于22 ℃下培養(yǎng)3～4 d,挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落,轉(zhuǎn)皿純化,多次純化后于-4 ℃環(huán)境下保存。

1.2.2 灰霉菌形態(tài)學觀察 將純化好的灰葡萄孢接種在產(chǎn)孢培養(yǎng)基[5](BC)上,于20 ℃下培養(yǎng)[5]10 d左右,待其產(chǎn)孢后,在光學顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征,并做好拍照記錄。

1.2.3 灰葡萄孢的分子生物學鑒定 將純化培養(yǎng)的霉菌菌絲刮取下來,用液氮研磨成粉末然后采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取灰葡萄孢DNA,擴增rDNA-ITS使用通用引物:ITS1(AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG);ITS4(TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC)。

PCR擴增反應體系為50 μL,包括雙鏈總DNA模板2 μL,上下游引物各2 μL,Master Mix25 μL,最后添加ddH2O定容至50 μL。反應條件:94 ℃熱變性2 min后,以94 ℃變性30 s、37 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min作35個循環(huán),再72 ℃延伸10 min。經(jīng)2%瓊脂糖(含 1 μg/mL溴化乙錠)電泳后,在紫外燈下觀察結(jié)果,擴增所得片段長度約520 bp,將得到的PCR產(chǎn)物純化后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序,測序完成后將測序結(jié)果在Genbank上進行比對。

1.2.4 菌懸液的配制 將灰葡萄孢接種至產(chǎn)孢培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)溫度為22 ℃,相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)10 d左右,待其產(chǎn)孢后,將培養(yǎng)好的灰葡萄孢菌絲和孢子刮下,將其溶于100 mg/L 的生理鹽水中,制成孢子數(shù)約為1×106個/mL的孢子懸浮液。

1.2.5 葡萄酒釀造實驗 人工貴腐葡萄原料的制作及酒樣釀造:預先對人工氣候箱進行酒精和紫外線消毒處理,然后調(diào)至溫度22 ℃,相對濕度85%,將新鮮采摘的約10 kg玫瑰蜜葡萄果實懸掛于氣候箱內(nèi),配制500 mL的孢子懸浮液,采用人工噴霧,非傷口接種的方法,于早上和晚上分別噴灑葡萄的表面,連續(xù)5 d重復操作,待果實表面產(chǎn)生一層薄薄的灰色霉層,即可將染病的葡萄漿果置于室外暴曬風干兩天左右,貴腐漿果發(fā)生皺縮,在這個過程中人工初步粒選已被灰葡萄孢侵染及表面附有菌絲的葡萄果實用于酒樣釀造。將制作好的貴腐葡萄果實5 kg人工快速除梗破碎,收集葡萄汁,放入5 L廣口玻璃瓶中,人工添加葡萄糖至總糖含量為320 g/L,添加50 mg/L的SO2,于4 ℃下放置24 h。待溫度上升為18 ℃左右的時候,按照0.2 g/L的量接種釀酒酵母,發(fā)酵溫度控制在22 ℃,當酒精度上升為13%vol左右時,添加60 mg/L的SO2終止發(fā)酵,然后將貴腐酒放置于4 ℃下靜置澄清,一個月后轉(zhuǎn)罐分離上清液,得到貴腐葡萄原酒,實驗兩次重復。

用未被貴腐菌感染的玫瑰蜜葡萄作對照樣,按照和上述相同的工藝進行釀造。

1.2.6 葡萄酒常規(guī)理化指標分析 還原糖用菲林試劑法測定;總酸用NaOH滴定法測定;酒精度用比重瓶法測定;干浸出物用比重瓶稱量法測定;揮發(fā)酸用雙沸式蒸餾法測定;游離SO2、總SO2用直接碘量法測定;pH用pH計測定。以上測定方法均按照GB 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的標準進行測定。

1.2.7 葡萄酒香氣成分分析 本研究香氣成分萃取采用固相微萃取法[13],DB-WAX色譜柱,30 m×0.25 m×0.25 μm;取8 mL樣品置于布魯克氣相色譜儀SCION SQ 456-GC 20 mL頂空瓶中,加入20 μL 100 μg/mL的2-辛醇作內(nèi)標,將老化后的75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于45 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口,于250 ℃解吸3 min,同時啟動儀器采集數(shù)據(jù),進行氣相色譜-質(zhì)譜分析。質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)WILEY8.0和NIST2014質(zhì)譜庫檢索,僅當匹配度大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果才予以報道。采用峰面積歸一化法定量計算出各揮發(fā)性成分在葡萄酒中的相對含量。

GC-MS分析條件[14]為載氣He,流速為1 mL/min。升溫程序為以40 ℃保持3 min,然后以4 ℃/min升至160 ℃,再以7 ℃/min升至 230 ℃,保持8 min。樣品注射體積為1 μL,不分流進樣。連接桿溫度230 ℃;進樣口溫度250 ℃。離子源溫度:230 ℃,電子源電壓70 eV,燈絲流量0.20 mA,檢測器電壓350 V,掃描頻率1 Hz。葡萄酒香氣物質(zhì)的萃取方法使用頂空固相微萃取(HS-SPME)的方法,取8 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,加入20 μL 100 μg/mL的2-辛醇作內(nèi)標,將老化后的75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于45 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口,于250 ℃解吸3 min,同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗進行了兩次平行,兩次重復,所有數(shù)據(jù)均按照兩次重復分析而得。分析數(shù)據(jù)及做圖表使用Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢的形態(tài)學鑒定

所分離的菌株在培養(yǎng)初期長出白色的“絨毛”,“絨毛”范圍逐漸擴大,菌落直徑增大,到培養(yǎng)的第7 d,菌落由白色開始轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑?第8 d菌絲體開始變成褐色,氣生菌絲相當發(fā)達,基內(nèi)菌絲集結(jié)成團,在第10 d開始產(chǎn)孢。在光學顯微鏡100倍放大下觀察菌株的孢子形態(tài)(如圖1),分生孢子梗呈葡萄穗狀,分生孢子呈球狀或橢球形,通過對比真菌分類鑒定手冊上的描述特征可初步鑒定為灰葡萄孢[12](Botrytiscinerea)。

圖1 菌株孢子形態(tài)Fig.1 Spore morphology of bacterial strain

2.2 灰葡萄孢的分子生物學鑒定

對初步鑒定為灰葡萄孢菌株的rDNA-ITS區(qū)序列進行測序分析。把測得的序列在GenBank上進行Blast比對,所得結(jié)果為測試菌株與已上傳的灰葡萄孢(Botrytiscinerea)序列相似率均大于或等于99%,其中和菌株MF741314(提交于韓國慶北國立大學農(nóng)業(yè)生命科學學院)和KY319171(提交于美國愛荷華州立大學植物病理與微生物學系)的相似率為100%,結(jié)合前面的形態(tài)鑒定,可以確定本研究所分的菌株為灰葡萄孢。

圖2 Blast比對結(jié)果Fig.2 Results of Blast comparison

2.3 葡萄酒基本理化指標

人工貴腐酒釀造完畢后對其常規(guī)理化指標進行分析,包括還原糖、酒精度、游離SO2和總SO2含量、干浸出物含量、總酸、pH和揮發(fā)酸含量。傳統(tǒng)甜紅葡萄酒和人工貴腐葡萄漿果所釀酒的常規(guī)理化指標分析結(jié)果見表1。

表1 試驗酒樣的常規(guī)理化指標Table 1 Conventional physical and chemicalindicators of sample wines

從表1可知,人工貴腐酒的酒精度、干浸出物、游離SO2含量、總SO2含量、pH、揮發(fā)酸均比對照酒樣高,總酸、還原糖比對照酒樣低,但這些指標相差并不大,葡萄酒的理化性質(zhì)主要受葡萄原料和釀造工藝的影響,所測結(jié)果指標均符合國家葡萄酒產(chǎn)品標準(GB 15037-2006)。

2.4 葡萄酒的香氣成分分析

本研究采用HS-SPME和GC/MS技術(shù)分別對人工貴腐酒和對照酒樣的揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測,測定結(jié)果為對照酒樣確定了29種揮發(fā)性成分,占總峰面積的99.51%,相對含量在0.03%～23.32%,其中有5種醇類物質(zhì),10種酯類物質(zhì),6種醛酮類物質(zhì),2種酸類物質(zhì),4種萜烯類物質(zhì)和2種其他香氣物質(zhì)組成;人工貴腐酒確定了42種揮發(fā)性成分,占總峰面積的95.77%,相對含量在0.02%～28.76%,其中有6種醇類物質(zhì),15種酯類物質(zhì),10種醛酮類物質(zhì),3種酸類物質(zhì),5種萜烯類物質(zhì)和3種其他香氣物質(zhì)組成,兩種酒樣的香氣組成出現(xiàn)了差異,且人工貴腐酒的香氣物質(zhì)種類要多于對照酒樣。

醇類物質(zhì)是在酒精發(fā)酵過程中的主要次級代謝產(chǎn)物之一,它能夠賦予葡萄酒典型性香味。酒精發(fā)酵過程中,釀酒酵母可以通過埃利希途徑(Ehrlich pathway)將支鏈氨基酸合成其自身所需要的氨基酸,同時伴隨著高級醇的產(chǎn)生[10]。相對于對照酒樣,人工貴腐酒中的異丁醇、異戊醇、苯乙醇的含量較高,這些物質(zhì)可以賦予葡萄酒的醇香和花香等。

在供試酒樣中,酯類物質(zhì)是檢測到的含量最高的一種揮發(fā)性物質(zhì),酯類物質(zhì)主要賦予葡萄酒的水果香和花香,人工貴腐酒樣中檢測到了15種酯類物質(zhì),對照酒樣中檢測到了10種,其中庚酸乙酯(水果香、白蘭地),丁二酸二乙酯(甜香、乳香),肉桂酸乙酯(奶油、草莓、肉桂)等只在人工貴腐酒中檢測到,但對照酒樣酯類物質(zhì)的總相對含量(68.02%)高于人工貴腐酒的(48.77%)。根據(jù)Tosi等[15]的研究,經(jīng)灰霉菌感染的葡萄汁中的酯酶活性會升高,從而造成貴腐酒中酯類物質(zhì)的總含量降低,這一結(jié)論和本試驗的結(jié)果相符。

葡萄酒中的大部分羰基化合物(醛和酮)主要是由微生物發(fā)酵生成的,由于其香氣閾值很低,所以對葡萄酒的香氣影響很大[16]。在本研究中對照酒樣中檢測到了6種醛酮類,人工貴腐酒樣中檢測到了10種,且總的相對含量也要高于對照,這很可能是受灰霉菌的影響。Chehab等[17-18]的研究表明,醛類物質(zhì)具有抑制真菌的作用,而人工貴腐酒中醛類物質(zhì)增加是葡萄本身對灰葡萄孢侵染的應激反應產(chǎn)生的[10]。其中甲基庚烯酮(柑橘)、庚醛(杏仁味)為人工貴腐酒所特有,正辛醛(橘子味)、3-羥基-2-丁酮(奶油、脂肪)、癸醛(香辛料)等物質(zhì)含量比對照高。

供試酒樣中,檢測到的酸類物質(zhì)較少,其中人工貴腐酒乙酸含量較高,這可能是由于貴腐菌的侵染致使葡萄汁中揮發(fā)酸含量增高。而己酸(干酪香、腐敗味),辛酸(奶油、脂肪酸)的相對含量則是對照比人工貴腐的要高。Tosi[15]等認為這是由于貴腐酒中的脂肪酸氧化作用和灰霉菌侵染引起的脂質(zhì)降解活動造成的。

萜烯類化合物一般是來源于果實本身的香氣。其中萜烯醇類的香茅醇(玫瑰香),里那醇(玫瑰花香、果香),4-萜烯醇(胡椒、木香)為人工貴腐酒含量高于對照,其他一些微量物質(zhì)對葡萄酒香氣貢獻較小,但這些含量稀少,種類較多的香氣物質(zhì),對葡萄酒香氣總體結(jié)構(gòu)的飽滿性和復雜度的增加有一定的作用。

3 結(jié)論與討論

玫瑰蜜葡萄屬歐美雜交種,是一種釀酒和鮮食兼用品種,在云南地區(qū)已有幾十年的栽培歷史,主要分布在彌勒和香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)[28]。用玫瑰蜜葡萄釀制的葡萄酒,酒體豐滿,呈寶石紅色,并具有特殊的水果芳香味[29]。本研究通過對成熟的玫瑰蜜葡萄進行人工接種貴腐菌,釀造玫瑰蜜貴腐葡萄酒,擬對云南葡萄酒產(chǎn)區(qū)人工貴腐酒的生產(chǎn)做一些嘗試。

表2 兩款酒樣的香氣成分的HS-SPME-GC-MS測定Table 2 HS-SPME-GC-MS determination of the aroma components of simple wines

本研究在感染灰霉病的夏黑葡萄果實上分離灰葡萄孢(B.cinerea)菌株,通過形態(tài)學和分子鑒定,確定分離菌株為灰葡萄孢(B.cinerea)。然后噴灑孢子懸浮液,用非傷口接種的方法對玫瑰蜜葡萄進行人工接種,在溫度為22 ℃,85%相對濕度的環(huán)境中,連續(xù)接種5 d,灰葡萄孢成功接種到玫瑰蜜葡萄上,隨即將被侵染的葡萄置于室外暴曬風干2 d左右,待其皺縮呈貴腐葡萄狀,人工粒選釀造貴腐葡萄酒。用HS-SPME-GC-MS分析人工貴腐酒的香氣成分,通過與對照相比,人工貴腐酒一共檢測到了42種香氣物質(zhì),對照檢測到了29種,并且具有更多種類的酯類和醛酮類化合物,使得人工貴腐玫瑰蜜葡萄酒具有更為豐富的香氣特性。

關(guān)于貴腐酒的特征香氣物質(zhì),由于都是用灰葡萄孢(B.cinerea)侵染過的葡萄所釀的酒,所以應該具有某些共同的香氣成分。Miklósy等[30]對匈牙利貴腐葡萄酒的香氣物質(zhì)進行了研究,認為α-內(nèi)酯和γ-內(nèi)酯為貴腐葡萄酒的特征香氣物質(zhì),而本研究的人工貴腐酒樣也有檢測到了γ-壬內(nèi)酯,而在對照中未曾出現(xiàn)。也有研究認為,醛酮類物質(zhì)的增加是貴腐酒的主要特征,陶永勝等[10]的研究認為,人工貴腐酒具有更多的醛類物質(zhì),主要是因為醛類物質(zhì)具有更強的抑菌活性來應對灰葡萄孢的侵染。蘭圓圓[11]在研究人工侵染的貴腐葡萄酒工藝的過程中,也發(fā)現(xiàn)一些羰基物質(zhì)只有在經(jīng)過灰霉菌處理的酒樣中才能檢測到,而在本研究中,同樣檢測到了比對照種類多且相對含量高的醛類物質(zhì),除了這些,還檢測到了更多種的醇類、酯類和萜烯類化合物,這些物質(zhì)增加了人工貴腐酒香氣的復雜性和豐富度。綜上所述,由于貴腐菌的作用,影響了葡萄酒的品質(zhì)和風格,貴腐酒是貴腐菌與釀酒葡萄相互作用的結(jié)果。

通過人工接種灰葡萄孢的方式獲得貴腐葡萄,釀造的人工貴腐玫瑰蜜葡萄酒具有較為豐富的香氣成分和較為復雜的香氣特征,并具有貴腐酒的典型性。驗證了使用玫瑰蜜葡萄釀造人工貴腐酒的可行性,這使得玫瑰蜜葡萄酒的產(chǎn)品更加多元化,香氣的探索和利用更加充分,同時為云南省釀造人工貴腐葡萄酒技術(shù)的可行性提供了參考,下一步則需要對人工貴腐酒的規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)進行探索。