王登峰，李建軍，劉志強，翁業(yè)斌，葛建軍，楊學云，吳建勇

(1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830013；2.新疆呼圖壁種牛場有限公司，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意義】奶牛乳腺炎是奶牛的多發(fā)病，我國臨床型奶牛乳腺炎的年頭發(fā)病率在2.3%～16.7%，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是奶牛乳腺炎的主要傳染性致病菌之一[1, 2]。該菌的常規(guī)分離方法是將乳樣接種于5%～7%的綿羊血瓊脂平板過夜培養(yǎng)，根據菌落的溶血和形態(tài)挑取疑似菌落擴大培養(yǎng)，通過生化試驗或分子生物學方法進行最終鑒定[3, 4]。該方法靶向性差，且平板培養(yǎng)的敏感性低而導致分離率低；為提高靶向性，可以使用分子生物學方法先對乳樣進行SA檢測，陽性樣本再進行常規(guī)方法分離、鑒定[4]，此方法費用較高；一些實驗室直接使用CHROM SA顯色培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基進行分離、鑒定[5, 6]，但仍存在瓊脂平板培養(yǎng)敏感性低、選擇性培養(yǎng)基價格普遍高等問題。【前人研究進展】同時，SA在臨床型、隱性乳腺炎樣本中的分離率普遍介于30%～50%，隨機奶樣中的分離率介于20%～50%[1]，表明雖然SA 感染可導致臨床型乳腺炎的發(fā)生，但不是所有感染SA的乳腺必然發(fā)生臨床型乳腺炎[7, 8]，建立準確評估SA感染與臨床型乳腺炎發(fā)生的相關性是控制SA性臨床乳腺炎的重點。已有研究證實SA感染導致的臨床型乳腺炎與感染菌株的毒力正相關[9, 10]，所以準確評價SA毒力是判斷是否導致臨床型乳腺炎發(fā)生的關鍵。此外，通過調查牛場中SA菌群的毒力分布可以評估養(yǎng)殖場發(fā)生臨床型乳腺炎的風險。【本研究切入點】目前評價細菌分離株毒力的方法主要是通過小鼠腹腔注射[3]或肌肉注射[11, 12]純培養(yǎng)物，觀察感染后小鼠死亡數量、死亡時間和病變程度等進行評價，該方法雖然簡單、直觀，但是對于毒力差異較大，中、弱毒力菌株小鼠致死率較低的SA菌株，用該方法進行評價則比較困難，并且需要耗費大量實驗動物，耗時長、費用也較高。研究建立可以定量測定SA主要致病因子溶血素的分泌量，進而評價菌株毒力的方法。【擬解決的關健問題】使用葡萄球菌選擇培養(yǎng)基mBP培養(yǎng)液結合CHROM SA顯色培養(yǎng)基對乳樣中的SA進行靶向分離，結合定量測定SA主要致病因子溶血素進而評價菌株毒力的技術，建立可適用于生產的SA感染情況調查和致臨床乳腺炎發(fā)生風險的評估方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

根據臨床檢查或隱性乳腺炎檢查法(CMT法)[13]檢測結果，初步判斷患臨床型、隱性乳房炎奶牛和健康泌乳牛(SCC<30萬)。以常規(guī)擠奶法棄掉前3把奶，用常規(guī)消毒液消毒乳頭及其附近區(qū)域，再用酒精棉球消毒乳頭。打開滅菌試管蓋，將試管保持水平狀態(tài)，將奶樣擠入試管中，蓋好試管蓋，冷藏運回實驗室。

2017年8～12月間，選取新疆昌吉州4個千頭規(guī)模的奶牛養(yǎng)殖場，共采集未經治療的臨床型乳腺炎乳樣64份、隱性乳腺炎乳樣(SCC≥30萬)157份和健康乳樣(SCC<30萬)213份[14]。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

葡萄球菌選擇培養(yǎng)液為mBP 培養(yǎng)液[15-16]，配方專利檢索號為(200610038812.0)，具體配制過程為：先將10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g丙酮酸鈉、12 g甘氨酸、5 g氯化鋰完全溶解于980 mL水中，再用氫氧化鈉溶液調pH至7.3，然后，于121℃下滅菌，冷卻至(50±10)℃時加入無菌1%亞碲酸鉀溶液10 mL和7 mL吐溫80，5 mL滅菌管，無菌分裝為2 mL/支，4℃保存。

科碼嘉金葡菌顯色培養(yǎng)基(CHROM SA培養(yǎng)基)購自北京賽為思生物技術開發(fā)中心，配制方法按照說明書進行。

改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基配制：哥倫比亞液體培養(yǎng)基(Gibco干粉培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，添加1.5%氯化鈉，用0.1 moL/L氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH值為7.0～7.5，在0.11 MPa壓力下滅菌20 min ，冷卻至(45～50℃)，按10%比例添加小牛血清(四季青，浙江天杭生物科技股份有限公司)混勻，10 mL滅菌管，無菌分裝為2 mL/支，4℃保存。

1.2.2 選擇性分離培養(yǎng)

采集的奶樣顛倒混勻后取100 μL接種 mBP 培養(yǎng)液中顛倒混勻，37℃培養(yǎng)18～24 h ，選擇培養(yǎng)液明顯渾濁并有黑色產物培養(yǎng)管，取50 μL涂布或劃線接種于科碼嘉金葡菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，SA菌落表現為紫紅色、紅色、粉紅色；挑取單菌落接種于改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基于37℃、150 r/min振搖培養(yǎng)20 h。

1.2.3 金黃色葡萄球菌毒力的快速評估

金黃色葡萄球菌分泌性溶血素的測定參見《一種可定量測定細菌分泌性溶血素活性的測定方法》，申請?zhí)枺?01710342810.9[17]。

1.2.3.1 試劑配制

貯存液：十二水磷酸氫二鈉 2.85 g、磷酸二氫鉀 0.27 g、氯化鈉17.00 g、加蒸餾水至100 mL，0.22 μm濾膜過濾后，4℃保存。

應用液：5 mL貯存液加95 mL蒸餾水，再加10%硫酸鎂0.1 mL，12 h內使用。

血細胞保存液：葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，氯化鈉0.42 g，蒸餾水100 mL，以上成分混勻后，微加溫溶解后，用檸檬酸鈉調節(jié)pH至6.1，并分裝在三角瓶中，115℃濕熱滅菌15 min。

1%綿羊紅細胞制備：無菌采取綿羊血液在等量的血細胞保存液中。使用前用3到10倍體積的應用液洗3次。1 500 r/min，前2次離心5 min，最后一次離心10 min。吸棄上清液，并使用應用液制成1%的細胞懸液。

1.2.3.2 毒力評價

使用定量測定SA分泌性溶血素活性的方法[17]對分離株進行毒力評估，可選用試管法和微孔法，試驗采用微孔法，詳細操作如下：

待測樣本準備：金黃色葡萄球菌分離株單菌落經改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基150 r/min振搖培養(yǎng)20 h后，取培養(yǎng)物1 mL，以8 000×g離心5 min，取500 μL上清，4℃可保存24 h，-80℃可保存60 d。

細菌溶血素量微孔法測定操作：

(1)稀釋毒素：待測毒素50 μL，應用液5 mL，稀釋度為1∶100。

(2)配制溶血標準孔：1%綿羊紅細胞800 μL加1 200 μL蒸餾水，混勻，即為全溶血孔，取250 μL加入全溶血孔。取全溶血孔液600 μL加應用液600 μL，即為50%溶血孔，取250 μL加入50%溶血孔，并使用同體積的應用液作空白對照孔。

(3)稀釋的待測毒素、緩沖液和紅細胞依次加入反應孔中(“V”型底微孔板較為合適)，混勻，置37℃水浴30 min。第0管為非溶血對照孔。每個孔做3個以上復孔。表1

表1 微孔法測定細菌毒素VH50Table 1 Bacterial toxin VH50 determined by microplate method

(4)結果測定：取出微孔板，800×g離心5 min，另取“U”型底微孔板，每孔吸取100 μL 到對應的“U”型底微孔板中，對照孔應不溶血。用分光光度計測(波長542 nm)OD值，計算復孔平均值，確定與標準50%溶血孔第1接近孔為終點孔，與終點孔緊鄰且與標準50%溶血管的OD542值第2接近孔為次終點孔，根據終點孔和次終點孔建立Y(OD542值)=aX(待測毒素添加量)+b線性方程，根據標準50%溶血管的OD542值計算待測毒素用量。然后按下公式計算VH50值：

細菌溶血素量(VH50 U/mL)=(1,00/毒素用量)×稀釋度。

乳樣中分離的SA單菌落接種于2 mL改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基于37℃、150 r/min振搖培養(yǎng)20 h后，培養(yǎng)上清中的溶血素量普遍在300～3 000 VH50 U/mL[17]，結合小鼠的毒力評價試驗[18]，初步確定：溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL為強毒力菌株，溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL為中等毒力菌株，溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL為弱毒力菌株。

1.3 數據處理

使用斯皮爾曼等級相關系數(Spearman correlation coefficient)分析菌株毒力與臨床型、隱性乳房炎和健康泌乳牛樣本之間的關系。計算公式為：

其中，n為樣本數，di=xi-yi.

2 結果與分析

研究表明,乳樣經葡萄球菌選擇培養(yǎng)液(mBP培養(yǎng)液)培養(yǎng)，呈現明顯渾濁并有黑色產物的試管表明樣本中存在葡萄球菌，臨床型乳腺炎乳樣、隱性乳腺炎乳樣和健康乳樣中mBP培養(yǎng)陽性率分別為64.1%、47.9%和20.2%。將mBP陽性培養(yǎng)物進一步劃線接種到CHROM SA顯色培養(yǎng)基，SA菌落顏色為紫紅色、紅色、粉紅色。經過靶向分離，分別從采集的3類樣本中分離出SA菌株27株、21株和17株，分離率為42.2%、13.4%和8.0%。表2

挑取CHROM SA顯色培養(yǎng)基上陽性單菌落接種于改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基，按照設定條件培養(yǎng)后，使用微孔法測定各菌株的溶血素分泌量，并將溶血素分泌量設定為3個范圍：≥1 500 VH50 U/mL、1 000～1 500 VH50 U/mL和<1 000 VH50 U/mL，分別對應為強毒力、中等毒力和弱毒力。結果顯示分離于3種類型的樣本中，溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL的菌株分別為9株(33.3%)、1株(4.8%)和2株(11.8%)、溶血素分泌量在1 000～1 500 VH50 U/mL的菌株：1株(4.8%)、13株(61.9%)和4株(23.5%)、溶血素分泌量在<1 000 VH50 U/mL的菌株：2株(11.8%)、7株(33.3%)和11株(64.7%)。經斯皮爾曼等級相關系數分析，臨床乳腺炎的發(fā)生與溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL(ρ=0.5，P=0.006 7)和≥1 000 VH50 U/mL(ρ=1，P=0.006 9)的SA(中、強毒力菌株)感染呈極顯著正相關；與溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL的SA(中毒力菌株)感染呈顯著正相關(ρ=0.5，P=0.021)，與溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL的SA(弱毒力菌株)感染呈不顯著負相關(ρ=-1，P=0.10)。

表2 不同類型乳樣中金黃色葡萄球菌的靶向分離和溶血素量分泌Table 2 Targeted isolation and hemolysin secretion of Staphylococcus aureus in different milk samples

注：1 培養(yǎng)液明顯渾濁并有黑色產物；2 菌落顏色為紫紅色、紅色、粉紅色
Note.1.The culture medium was obviously turbid and had black products; 2.The colony color was purplish red, red or pink

3 討 論

金黃色葡萄球菌(SA)是奶牛乳腺炎的主要傳染性致病菌之一，該菌的常規(guī)分離方法較多[19, 20]，研究中使用葡萄球菌選擇培養(yǎng)基mBP 培養(yǎng)液進行選擇性增菌，由于mBP培養(yǎng)液分離SA的靈敏度為60個細菌[15]，經擴增培養(yǎng)后，再使用CHROM SA顯色培養(yǎng)基進行單菌落分離使分離效率較大提高，也降低了費用，適合奶牛養(yǎng)殖場中SA感染調查。同時建立快速測定細菌分離株溶血素產量的毒力評價方法，不依賴實驗動物，通過分離株的毒力評估感染牛發(fā)生臨床型乳腺炎的風險。

金黃色葡萄球菌可產生溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等毒素，產生毒素量和生物活性的差異使不同菌株的致病力差異較大[21-23]，其中溶血素是SA的主要毒素之一[23]。細菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)綿羊血紅細胞，當紅細胞和溶血素量一定時，在規(guī)定反應的時間內，溶血程度與溶血素量和生物活性呈正相關。在接近50%的紅細胞溶血(VH50)時，二者之間近似直線關系，由此定義引起1 mL，1%濃度的完整綿羊紅細胞中50%的細胞溶血所需的最小毒素量為一個VH50 U，據此計算出待測細菌液體培養(yǎng)時上清中分泌的溶血素的量。在相同的培養(yǎng)條件下，可以通過比較相同細菌數量的溶血素產量確定不同分離株的毒力差異。研究結合小鼠后肢肌肉攻毒、根據病變指數評分的毒力評價試驗[18]，初步確定：SA溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL為強毒力菌株，溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL為中等毒力菌株，溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL為弱毒力菌株。

目前，淘汰SA感染導致的臨床型乳腺炎患病牛，逐步根除SA在牛群中的感染是控制奶牛乳腺炎的重要方案。在我國，SA 在臨床型、隱性乳腺炎樣本中的分離率普遍介于30%～50%，隨機奶樣中的分離率介于20%～50%[1]，表明該方案對大部分牛場并不適用。臨床乳腺炎的發(fā)生與微生物的感染、擠奶等物理因素和奶牛自身的遺傳等多種因素相關，研究采用斯皮爾曼等級相關系數(ρ)分析臨床乳腺炎和不同溶血素分泌量菌株的相關性。斯皮爾曼等級相關系數(ρ)是反映兩組變量之間聯(lián)系的密切程度，ρ∈(1，-1)，當ρ=1時表示臨床乳腺炎和溶血素分泌量秩次完全相同；當ρs=-1時，表示兩者的秩次完全相反；當ρs=0時，則兩者不相關。對臨床型乳腺炎乳樣、隱性乳腺炎乳樣和健康乳樣中分離的SA使用建立的方法進行定量溶血素測定，經斯皮爾曼等級相關系數分析發(fā)現，臨床乳腺炎與感染溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL(中、強毒力)菌株比例的秩次完全一致(P=1)，即呈正相關；與溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)菌株感染比例的秩次完全相反(P=-1)，即呈負相關。一旦感染乳腺中分離出中、強毒力SA，其發(fā)生臨床型乳腺炎的風險較大；同時，根據奶牛養(yǎng)殖場中SA的感染數據和菌群中、強毒力菌株的流行情況可以初步預測臨床型奶牛乳腺炎的年頭發(fā)病率。

對規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，每年使用該方法開展1～2次的SA感染率和菌群毒力調查，對中、強毒力菌株進行藥物敏感性試驗，可初步預測臨床型奶牛乳腺炎的年頭發(fā)病率，使用篩選的敏感抗生素治療可減小乳腺炎的治療周期和提高治愈率，并且通過徹底治愈、殺滅患病牛攜帶的耐藥菌株，減少耐藥株的擴散。

研究未考慮不同菌株增殖速度的差異，未計算相同細菌數量時的溶血素產量。在建立測定溶血素量的試驗中發(fā)現在相似的接種量(單菌落)和一致的培養(yǎng)條件下，同一菌株的測試結果比較穩(wěn)定，不同菌株的細菌數量有差異，但其導致的各菌株的溶血素量測定結果與相同細菌數量下測定的結果相比，變化范圍絕對值介于10～100 VH50 U/mL[17]，不影響毒力的判斷。方法中采集的各種類型的乳樣數量和與各類型樣本相關聯(lián)的SA菌株數量仍較少，需要在臨床上進一步補充樣本量。

4 結 論

建立了葡萄球菌選擇培養(yǎng)基結合CHROM SA顯色培養(yǎng)基高敏感度(60 cfu)靶向分離乳樣中金黃色葡萄球菌的方法，并建立了定量測定分泌性溶血素評價金黃色葡萄球菌毒力的方法，金黃色葡萄球菌性臨床型乳腺炎的發(fā)生與感染中、強毒力菌株(溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL)呈正相關，與感染弱毒力(溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL)菌株呈負相關。