王德鋼,馬光皇,賀鵬鵬,熊仁次,曹 玉,張 萍,韓 旭,楊明祿,3

(1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾，843300；3.農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測(cè)站，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】香梨優(yōu)斑螟(Euzopherapyriella)屬鱗翅目螟蛾科斑螟亞科優(yōu)斑螟屬[1]，為新疆香梨產(chǎn)區(qū)特有的果樹蛀干害蟲。該蟲廣泛分布在新疆烏魯木齊、塔城、博樂(lè)、伊寧、昌吉、哈密、吐魯番、庫(kù)爾勒和阿克蘇等地，主要寄主有梨、蘋果、無(wú)花果、棗、杏、巴旦杏、桃和楊樹等。部分產(chǎn)區(qū)被害率高達(dá)50%，為害嚴(yán)重的，造成樹體的大量死亡[2]，在阿克蘇地區(qū)5年以上香梨盛果園內(nèi)香梨優(yōu)斑螟危害率達(dá)100%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。脂肪中不飽和脂肪酸的比例影響著生物體細(xì)胞膜的流動(dòng)性，在低溫狀態(tài)下這種流動(dòng)性顯得尤為重要，合成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶之一脂肪酸去飽和酶成為研究生物耐寒機(jī)制中的熱點(diǎn)。另一方面，脂肪酸去飽和酶在昆蟲性信息素合成中也起到非常重要的作用[3]。研究脂肪酸去飽和酶對(duì)昆蟲繁育和生活習(xí)性方面有重要作用，對(duì)有害昆蟲的成災(zāi)機(jī)制研究有重要意義。【前人研究進(jìn)展】脂肪酸去飽和酶根據(jù)作用底物及結(jié)合載體、存在的狀態(tài)和引入雙鍵的位置等差異有3種分類方式：(1)根據(jù)酶作用的底物以及結(jié)合載體的不同，可以分為?；o酶A去飽和酶(acyl-CoA FAD)，主要存在于動(dòng)物及真菌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，作用底物是與CoA結(jié)合的脂肪酸；?；?ACP去飽和酶(acyl-ACP FAD)，存在于植物的葉綠體或質(zhì)體的基質(zhì)中，作用底物是與ACP結(jié)合的脂肪酸，也是脂肪酸去飽和酶家族唯一可溶性酶；?；救ワ柡兔?acyl-lipid FAD)，主要存在于高等植物和藍(lán)藻中，作用底物是以結(jié)合脂形式存在的脂肪酸[4]。(2)依據(jù)脂肪酸去飽和酶的存在狀態(tài)，可分為可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白，除了植物的acyl-ACP FAD是唯一可知的可溶性去飽和酶，其余的都是膜結(jié)合的FAD[5-6]。(3)根據(jù)去飽和過(guò)程中引入雙鍵的位置脂肪酸去飽和酶又可分為“前端”去飽和酶和“甲基端”去飽和酶兩類[7-8]。FAD9在真核細(xì)胞中是普遍存在的，對(duì)調(diào)控膜的流動(dòng)性起著重要作用，其在脂肪酸去飽和酶家族中相對(duì)其他基因研究倍受關(guān)注。2002年從家蠅(Muscadomestica)體內(nèi)克隆出FAD9去飽和酶基因[9]，后續(xù)從斜紋夜蛾(Ctenopseustisobliquana)等昆蟲的體內(nèi)克隆了FAD9去飽和酶基因[10]，之后在脂肪酸去飽和酶的研究中在毛眼林蟻(Formicaexsecta)轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了FAD9基因，并認(rèn)為該基因?qū)ξ浵伈煌瑐€(gè)體之間的相互交流存在非常重要的作用[11]，家蠶轉(zhuǎn)錄組中也鑒定得到很多脂肪酸去飽和酶基因家族的成員，其中包含F(xiàn)AD9基因[12]。不飽和脂肪酸作為耐寒物質(zhì)早就被人們所關(guān)注，但關(guān)于FADs基因與昆蟲耐寒性方面的研究，起步明顯較晚，直到2007年，在蔥蠅(Deliaantique)中首次被證實(shí)了脂肪酸去飽和酶Δ9基因與耐寒性的關(guān)系，當(dāng)溫度降低時(shí)，在冷馴化和滯育蛹的腦、中腸和馬爾皮吉亞小管中，mRNA中的Δ9基因表達(dá)上調(diào)了2～10倍，這與增強(qiáng)耐寒性存在很明顯的相關(guān)性[13]，這也表明了昆蟲的耐寒性與FAD9的緊密關(guān)系，當(dāng)受到外界低溫刺激時(shí)，昆蟲FAD9基因表達(dá)上升以此增強(qiáng)自身抗寒能力，由此逐漸開始了從FADs家族研究昆蟲抗寒能力。目前，已有許多在昆蟲耐寒性方面的研究表明其耐寒性與脂肪酸△9去飽和酶基因存在聯(lián)系。對(duì)紅尾肉蠅滯育相關(guān)基因進(jìn)行分析時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)了脂肪酸△9去飽和酶基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)[14]；利用qPCR技術(shù)對(duì)滯育時(shí)期白紋伊蚊進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在低溫下滯育6 d后的FAD9基因是未滯育的FAD9基因表達(dá)量的1.8倍[15]；在對(duì)彈尾目跳蟲耐寒性的研究中發(fā)現(xiàn)，5℃下48 h后，F(xiàn)AD9基因表達(dá)量上升了5倍，這些均表明了昆蟲通過(guò)增加FAD9基因表達(dá)量來(lái)提高不飽和脂肪酸含量，進(jìn)而提升其耐寒性[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究該基因序列隆鑒定后進(jìn)行生物信息學(xué)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)該基因在3種不同蟲態(tài)下的表達(dá)量進(jìn)行研究，分析香梨優(yōu)斑螟在變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的不同階段該基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蟲源

采集阿拉爾市塔里木大學(xué)校園內(nèi)梨園香梨優(yōu)斑螟老熟幼蟲，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)待其化蛹、羽化，所得幼蟲、蛹和成蟲，分別用液氮處理后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

總RNA提取為TRIzon總RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix，用于PCR擴(kuò)增的Taq酶均購(gòu)自康為世紀(jì)公司；用于PCR擴(kuò)增的dNTP Mixture (10 mM)，熒光定量試劑SGExcel UltraSYBR Master 預(yù)混液均購(gòu)自上海生工生物(工程)有限公司；克隆試劑盒pMDTM19-T Vector Cloning Kit購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans5α Chemically Competent Cell和瓊脂糖凝膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit購(gòu)自北京全式金生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 香梨優(yōu)斑螟FAD9基因擴(kuò)增、克隆

1.2.1.1 總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzon總RNA提取試劑提取RNA，并用核酸檢測(cè)儀(NanoDrop 2000，Thermo公司)檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量濃度。按照 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix 試劑盒步驟去除總RNA中少量基因組DNA，并以1.0 μg總RNA為模板合成cDNA，稀釋10倍后-20℃保存。

1.2.1.2EpFAD9簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索FAD9基因編碼蛋白序列，選取甘藍(lán)夜蛾ABX90048.1、小地老虎AGR49311.1、美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)AAF81790.2、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)AAL27034.1、紅帶卷蛾(Argyrotaenia velutinana)AAF44709.1、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)AAB92583.1、蘋淡褐卷蛾AAL35750.1氨基酸序列，然后提交到CODEHOP 服務(wù)器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，挑選出3對(duì)引物由上海生工合成。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性 94℃ 3 min ；變性 95℃ 30 s，復(fù)性 54℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)；終延伸10 min。利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物，連接至 pMD19-T Vector 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，培養(yǎng)12～16 h后挑取單克隆菌進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，選取理想目標(biāo)菌液，送上海生工測(cè)序測(cè)序。

1.2.2 熒光定量

1.2.2.1 總RNA提取與cDNA合成

幼蟲、蛹和成蟲每個(gè)蟲態(tài)各3只，提取方法與cDNA合成同3.3.1。

1.2.2.2EpFAD9熒光定量引物設(shè)計(jì)與qPCR

利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)EpFAD9已知序列設(shè)計(jì)特異引物，以香梨優(yōu)斑螟18 s內(nèi)參基因?yàn)閷?duì)照基因[17]，引物由上海生工合成，qPCR反應(yīng)采用熒光染料 SYBR GreenⅠ，根據(jù)SGExcel UltraSYBR Master試劑盒說(shuō)明書要求，使用10 μL體系，在Mastercycler ep realplex中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序采用3步法，條件為：95℃ 3 min(預(yù)變性)，95℃ 15 s(變性)，56℃ 20 s(退火)，72℃ 25 s(延伸)， 40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 EpFAD9基因定量引物Table 1 Real-time PCR primers of EpFAD9 Gene

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用NCBI的ORF Finder工具推測(cè)序列的蛋白質(zhì)氨基酸序列；BLAST搜索同源性序列，用MEGA軟件分析蛋白質(zhì)氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；并用Protparam軟件(https://web.expasy.org/ protparam/)對(duì)蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用SignalP 4.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析該蛋白信號(hào)肽；TMHMM Server v2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析預(yù)測(cè)的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；用ProtScale軟件(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)該蛋白親疏水性；用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=npsa_sopma.html)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://www.swissmo-del.expasy.org/)中的自動(dòng)方式(automated mode)進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)；用NetPhos 3.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/)分析EpFAD9蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)；用PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/ form2.html)工具預(yù)測(cè)該蛋白產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位；EpFAD9基因在不同蟲態(tài)的相對(duì)表達(dá)分析采用相對(duì)定量法(2-△△CT法)計(jì)算[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 EpFAD9基因克隆

總RNA提取結(jié)果經(jīng)檢測(cè)OD260/280與OD260/230比值均在1.9～2.0，簡(jiǎn)并引物使用普通PCR擴(kuò)增方法篩選后合適引物為EpFAD9F：5'-CGACCCTATCCTGAGATTCCAGAARAARTAYTA-3'，EpFAD9R：5'-GCCTTCTCCGAGCGRAARAARTA-3'，利用該簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆測(cè)序后得到一段長(zhǎng)為268 bp的核酸序列，通過(guò)對(duì)該實(shí)驗(yàn)室香梨優(yōu)斑螟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1條3 822 bp的此基因序列，并包含了完整開放閱讀框，分析了基因的蛋白特性等信息。

2.2 EpFAD9基因生物信息學(xué)

2.2.1 蛋白特性

該基因的開放閱讀框長(zhǎng)度為1 056 bp，編碼352個(gè)氨基酸，起始密碼子位于序列第1 280堿基ATG，終止密碼子位于序列第2 338堿基TAA。圖1

注：灰色表示FAD9的起始密碼子ATG和終止密碼子TAA
Note:Grey indicates the initiation codoni ATG and termination codon TAA ofFAD9

圖1 香梨優(yōu)斑螟FAD9基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences ofEuzopherapyriellaFAD9

對(duì)EpFAD9推測(cè)氨基酸序列的分子式為C1895H2800N496O496S7，原子總數(shù)5 694，相對(duì)分子量為40 690.52 u；理論等電點(diǎn)是9.09，呈堿性；帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)總數(shù)為32，帶正電殘基(Arg + Lys)總數(shù)為38。

該蛋白共由20種氨基酸組成，丙氨酸(Ala)最多，有35個(gè)占總數(shù)的9.9%，其次為亮氨酸(Leu)，有31個(gè)，占總數(shù)的8.8%，含量最少的是半胱氨酸(Cys)，只有1個(gè)，占總數(shù)的0.3%，沒(méi)有吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。表2

2.2.2EpFAD9系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性

將EpFAD9氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blastp分析，結(jié)果顯示與煙草天蛾(Manducasexta)相似度達(dá)到89%，與蘋淡褐卷蛾(Epiphyaspostvittana)、馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)等其它16個(gè)昆蟲物種FAD9相似度都達(dá)到了80%以上。

將17個(gè)物種FAD9編碼的氨基酸序列利用Mega 7.2的鄰接法NJ(bootstrap檢驗(yàn)，1 000次重復(fù))聚類分析、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，香梨優(yōu)斑螟與煙草天蛾在一分支上，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近，與歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、柞蠶(Antheraeapernyi)等4種昆蟲親緣關(guān)系較近，與大頭金蠅(Chrysomyamegacephala)、薔薇斜條卷葉蛾(Choristoneurarosaceana)、平行卷葉蛾(Choristoneuraparallela)和蘋淡褐卷蛾、甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)等幾種夜蛾、卷蛾科的昆蟲關(guān)系較遠(yuǎn)。圖2

2.2.3EpFAD9蛋白信號(hào)肽

EpFAD9蛋白信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白最大C分值為0.117、最大Y分值為0.114以及最大S分值為0.131，均小于閾值(0.500)，因此，認(rèn)為EpFAD9無(wú)明顯的信號(hào)肽。圖3

圖2 香梨優(yōu)斑螟及其他昆蟲FAD9氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.2 Phylogenetic tree construction ofFAD9 amino acid sequence ofEuzopherapyriellaand other insects

圖3EpFAD9基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)
Fig.3 Amino acid composition ofEpFAD9 gene signal peptide prediction

2.2.4EpFAD9蛋白跨膜結(jié)構(gòu)

研究表明,EpFAD9蛋白有4個(gè)跨膜螺旋，其位置分別位于第39-61、71-93、186-208和213-235氨基酸序列。圖4

2.2.5EpFAD9蛋白親疏水

研究表明,香梨優(yōu)斑螟FAD9蛋白中親水性最強(qiáng)的是第34位的天冬酰胺(Asn)和第128位的甲硫氨酸(Met)，疏水性最強(qiáng)的是第48位的丙氨酸(Ala)和第193位的亮氨酸(Leu)，親水性氨基酸總數(shù)多于疏水性氨基酸，并且親水性最大值明顯大于疏水性最大值，該蛋白整體為偏向親水性。圖5

2.2.6EpFAD9蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

香梨優(yōu)斑螟FAD9蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋130個(gè)氨基酸所占比例為36.93%，延伸鏈59個(gè)氨基酸占比例為16.76%，無(wú)規(guī)卷曲147個(gè)氨基酸占41.76%，β-轉(zhuǎn)角16個(gè)氨基酸所占比例為4.55%。圖6

在預(yù)測(cè)的香梨優(yōu)斑螟FAD9蛋白的三維結(jié)構(gòu)建模中，螺旋結(jié)構(gòu)和不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例很大，少量延伸鏈狀結(jié)構(gòu)，這也與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。圖7

圖4EpFAD9基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)
Fig.4 Amino acid composition ofEpFAD9 gene transmembrane structure analysis

2.2.7EpFAD9蛋白磷酸化位點(diǎn)

在預(yù)測(cè)的EpFAD9蛋白中，含有15個(gè)絲氨酸(Ser)、21個(gè)蘇氨酸 (Thr)、 19個(gè)酪氨酸(Tyr)，其中潛在磷酸化位點(diǎn)有7個(gè)絲氨酸、7個(gè)蘇氨酸和4個(gè)酪氨酸。圖8

圖5EpFAD9基因編碼蛋白親疏水性
Fig.5 Amino acid composition ofEpFAD9 gene hydrophilic-hydrophobic analysis

注：A.二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 B.峰值變化
Note:A.secondary structure analysis B.Peak change

圖6EpFAD9基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)
Fig.6 Amino acid composition ofEpFAD9 gene secondary structure analysis

圖7EpFAD9基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
Fig.7 Amino acid composition ofEpFAD9 gene Tertiary structure prediction

2.2.8EpFAD9蛋白亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)一般通過(guò)算法比較查詢序列中所包含的特征參數(shù)與各類相應(yīng)的亞細(xì)胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式作出判斷。

預(yù)測(cè)EpFAD9編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，其分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為44.4%，分布在線粒體中的可能性為22.2%，分布在高爾基體的可能性同樣是22.2%。表3

圖8EpFAD9基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)
Fig.8 Amino acid composition ofEpFAD9 gene phosphorylation site analysis

表3 EpFAD9基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位Table 3 Amino acid composition of EpFAD9 gene Subcellular localization analysis

2.3 EpFAD9基因表達(dá)

利用 qPCR 檢測(cè)香梨優(yōu)斑螟不同蟲態(tài)的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在香梨優(yōu)斑螟的成蟲和蛹期表達(dá)量差異很小，都維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平，但是，該基因在幼蟲期高水平表達(dá)，極顯著高于成蟲期和蛹期，相對(duì)表達(dá)量分別是成蟲期的17.75倍，蛹期的29.59倍。圖9

圖9EpFAD9基因在不同蟲態(tài)中的基因相對(duì)表達(dá)量
Fig.9 Relative expression ofEpFAD9 gene in different insect States

3 討 論

香梨優(yōu)斑螟以幼蟲越冬，在越冬期間不飽和脂肪酸相對(duì)含量均高于越冬前后期，飽和脂肪酸則與之相反，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的相對(duì)含量和比例的變化對(duì)香梨優(yōu)斑螟滯育幼蟲越冬起到關(guān)鍵作用[19]。而FAD9基因是不飽和脂肪酸合成通路中的首個(gè)去飽和酶，它對(duì)油酸(C18∶1)及亞油酸(C18∶2)等不飽和脂肪酸合成有重要作用，這2種不和脂肪酸在昆蟲體內(nèi)占有較大比例，對(duì)生物膜流動(dòng)性有重要作用[20]。昆蟲FAD為膜結(jié)合蛋白，序列在兩端保守性低，也是許多生物活性分子如性信息素的前體物質(zhì)，對(duì)多細(xì)胞有機(jī)體的細(xì)胞生物學(xué)功能起著重要的維系和調(diào)節(jié)作用[21]。

EpFAD9基因開放閱讀框長(zhǎng)1 056 bp，編碼352個(gè)氨基酸，其長(zhǎng)度與斜紋夜蛾、海膽卷蛾(Ctenopseustisherana)[22]和小地老虎(Agrotisipsilon)[23]等昆蟲FAD9基因蛋白編碼長(zhǎng)度一致，氨基酸組成中丙氨酸最多，有35個(gè)占總數(shù)的9.9%，不含有吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸，在對(duì)弓形蟲FAD9基因的研究結(jié)果同樣顯示為丙氨酸的含量最高[24]。氨基酸組成與與蛋白折疊息息相關(guān)，決定了蛋白質(zhì)親疏水性，EpFAD9編碼蛋白質(zhì)為親水性蛋白，推測(cè)其包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與多數(shù)真核生物脂肪酸△9去飽和酶基因相同[25-27]，跨膜結(jié)構(gòu)是由跨膜蛋白的效應(yīng)區(qū)域所展現(xiàn)，包括細(xì)胞能量交換及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物膜功能。磷酸化位點(diǎn)是蛋白翻譯后的重要修飾位點(diǎn)，與信息的識(shí)別與傳遞有關(guān)，對(duì)調(diào)節(jié)蛋白的功能發(fā)揮著重要作用[28]。在對(duì)EpFAD9編碼蛋白的預(yù)測(cè)中顯示有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，從而更有利于該蛋白質(zhì)與機(jī)體內(nèi)其他分子或蛋白相互作用，也表明EpFAD9蛋白質(zhì)酶活力較強(qiáng)。對(duì)EpFAD9蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),其可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體發(fā)揮其生物學(xué)作用，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這一預(yù)測(cè)結(jié)果與在小鼠中研究結(jié)論相同[26]。

脂肪酸去飽和酶基因作為合成通路中的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平高低直接影響昆蟲體內(nèi)不飽和脂肪酸積累，香梨優(yōu)斑螟幼蟲狀態(tài)下EpFAD9含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛹和成蟲，說(shuō)明香梨優(yōu)斑螟幼蟲時(shí)期不飽和脂肪酸的代謝速度遠(yuǎn)高于成蟲期和蛹期，可能為變態(tài)發(fā)育過(guò)程準(zhǔn)備充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[29]。由此推測(cè)香梨優(yōu)斑螟幼蟲抵抗低溫能力更強(qiáng)，這與香梨優(yōu)斑螟以幼蟲越冬相吻合[30]。蛹和成蟲的FAD9基因表達(dá)量相對(duì)較低，可能這2種蟲態(tài)多以脂肪消耗代謝為主有關(guān)。

4 結(jié) 論

EpFAD9基因基因在香梨優(yōu)斑螟不同蟲態(tài)下存在表達(dá)差異，在幼蟲體內(nèi)的表達(dá)量最高，成蟲和蛹期的表達(dá)很低，尤其是蟲蛹，其表達(dá)量更低于成蟲，蟲蛹和成蟲狀態(tài)下的香梨優(yōu)斑螟對(duì)低溫抵抗能力都低于幼蟲。