車玉紅 ,楊 波,郭春苗 ,木巴熱克·阿尤普 ,吳津蓉,杜 鵑

(1.新疆農業(yè)職業(yè)技術學院, 新疆昌吉 831100；2.新疆農業(yè)科學院園藝作物研究所, 烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】榅桲(CydoniaoblongaMill.)，俗稱木梨、新疆木瓜、比也等，為薔薇科榅桲屬植物，具有重要的藥用價值和經(jīng)濟價值[1]。榅桲是新疆古老的栽培果樹，主要分布在天山以南沿塔里木盆地邊緣的綠洲，栽培面積在1 000 hm2以上。榅桲果肉呈高度木質化狀態(tài)，嚴重影響了其作為水果鮮食的口感[2,3]?！厩叭搜芯窟M展】榅桲果實果肉的木質化與木質素的合成、轉運及沉積密切相關。肉桂醇脫氨酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD),是木質素合成途徑中的重要的限速酶，它是催化木質素單體合成最后一步反應的關鍵酶[4]，同時CAD是比較理想的用于改良植物品質的基因。近年來國內外學者對CAD基因進行了多方面的研究，目前已經(jīng)從高粱[5]、水稻[6]、短柄草[7]、小麥[8]、楊樹[9]等多種植物中克隆得到CAD基因，并且還研究發(fā)現(xiàn)CAD的基因的表達和CAD酶活性在芽、葉、枝、根等不同組織中活性和表達量有明顯差異。R Blanco-Portales等[10]在草本水果草莓、Shan L L等在木本水果枇杷[11]果肉中研究都發(fā)現(xiàn)了CAD基因在調節(jié)果實發(fā)育和影響果實品質方面同樣發(fā)揮著重要作用。目前，關于榅桲的研究主要集中在營養(yǎng)成分[3]、香氣[12]、果實要用價值[13-15]等。【本研究切入點】但在果肉木質素形成與CAD基因的關系等方面的研究還未見報道。研究榅桲果實CAD基因的克隆、序列分析及表達?！緮M解決的關鍵問題】以榅桲果肉為研究對象，通過RT-PCR、基因克隆和定量PCR技術，鑒定榅桲果肉中CAD基因的序列信息，分析CAD基因在榅桲果實發(fā)育過程中的表達變化規(guī)律，榅桲果實木質素形成機理提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料采自新疆喀什地區(qū)莎車縣伊什庫里鄉(xiāng)榅桲示范園，供試品種為當?shù)卮蠊麡X桲，樹齡為15年生，樹勢健壯，土肥管理一致。

榅桲采樣落花后10 d(4月20日)，40 d(5月20日)，70 d(6月20日)，100 d(7月20日)，130 d(8月20日)，160 d(9月20日)共6次樣。果實采樣后冰塊保存送至烏魯木齊實驗室-80℃超低溫冰箱保存。 表1

表1 榅桲果實發(fā)育規(guī)律Table 1 Development of quince fruit

植物多糖多酚總RNA提取試劑、盒膠回收試劑盒購自北京天根公司；轉錄酶M-MLV、高保真DNA聚合酶PrimerSTAR、T4 DNA連接酶均購自大連TAKARA公司；質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取

取100 mg榅桲果實組織樣品在液氮中研碎，按照植物多糖多酚總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度計測其純度，OD230/OD260比值為1.75，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，質量完好的RNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的CAD基因序列，選取以下5個物種進行同源性比對，選擇近源物種蘋果(XP_028965477.1)、白梨(AKC35072.1)、枇杷(QCH01347.1)、櫻桃(XP_021816061.1)、桃(XP_007199637.1)、月季(XP_024165251.1)、胡桃(XP_018827699.1)等5個序列，針對高度同源性區(qū)域，分別設計引物PCR擴增。

利用Oligo 6.0軟件，設計擴增CAD全長編碼區(qū)的CAD-CDS引物。以果實組織1 μg總RNA模板，依照反轉錄酶說明書進行轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，利用高保真酶PrimeStar進行全長編碼區(qū)擴增，反應體系：2 μL cDNA模板，2.5 μL 5×PS buffer，2 μL dNTP (各2.5 mmol/L)，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，1U Primer Star酶，用雙蒸水調整至25 μL。PCR反應條件:94℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 20 s，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)，72℃10 min。PCR產物利用DNA膠回收試劑盒進行回收，連接至pMD-19T載體(TAKARA)。由上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。表2

表2 CAD基因克隆引物序列Table 2 Primer sequence for cloning CAD gene

1.2.3 序列分析與結構預測

通過BLAST數(shù)據(jù)庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov)，初步分析核苷酸序列、氨基酸序列的相似性；將相關物種CAD基因的氨基酸序列下載，在DNAstar軟件上進行同源比對；同時用MEGA3.1軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 間苯二酚染色

將花后落花后40、70、100、130和160 d(落花后10 d果實不具備染色條件)的榅桲果實從中間部位橫切切成2半，放在培養(yǎng)皿中，用1%的間苯三酚溶液和濃鹽酸1:1(體積比)的混合液倒入培養(yǎng)皿中浸泡15 min，待榅桲果肉完全顯色后拍照，觀察果肉木質素的積累程度。

1.2.5 定量PCR檢測

Oligo6.0軟件設計CAD和內參基因GAPDH定量引物。定量檢測引物送交上海生工公司合成。榅桲果實經(jīng)液氮研磨，通過多糖多紛試劑盒提取總RNA，取1 μg總RNA進行反轉錄合成cDNA。使用QuantiTect SYBR GreenI試劑(QIAGEN)進行定量PCR檢測(Light Cycler 480, Roche)。反應程序：95℃10 min；95℃ 15 s- 58℃ 20 s - 72℃ 20 s，50 cycles；melting curve: 99℃ 0 s- 65℃ 15 s- 99℃ 0.1℃/s；cooling- 40℃, 30 s。 反應體系：2×Master mix 10 μL；primer (10 pM) mix 1 μL；cDNA 2 μL；RNase free water 7 μL。每個樣品重復3次。利用2-△△CT法對cDNA中CAD基因的相對表達量進行統(tǒng)計分析。表3

表3 基因定量檢測引物序列Table 3 Amplification primers for Quantitative RT-PCR

2 結果與分析

2.1 榅桲CAD基因克隆

研究表明,各物種間CAD基因在中間區(qū)域具有高保守性，但是兩端保守性較低，特別是5’端差異性較大。以榅桲果實cDNA為模板進行PCR，擴增出一條約1 kb左右的特異性條帶。條帶清晰，片段大小與預期的相符。圖1

PCR產物回收，克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定，對陽性克隆測序。PCR所得的開放閱讀框長為1 071 bp，編碼356個氨基酸，以ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子。圖2

圖1 榅桲CAD基因擴增電泳
Fig.1 Amplification ofCADgene

圖2 榅桲CAD基因核苷酸和氨基酸序列
Fig.2CADgene nucleotide and amino sequence

2.2 榅桲CAD基因的同源性比對

研究表明,蘋果96.63%，白梨95.79%，枇杷93.26%，月季87.32%，桃92.11%，櫻桃91.55%，胡桃87.89%，海島棉85.92%，亞麻80.00%，桑樹83.38%，擬南芥43.59%，煙草83.94%。圖3

2.3 榅桲CAD氨基酸組成及進化樹

研究表明,榅桲CAD基因編碼356個氨基酸。氨基酸殘基組成分析顯示，Leu(8.99%)、Ala(4.49%)、Thr (5.34%)、Ser(6.46%)、Gly(10.39%)等氨基酸的使用頻率較高。表4

榅桲CAD基因與蘋果和白梨聚類在一起，與擬南芥進化關系最遠。圖4

2.4 榅桲果實木質素的積累動態(tài)變化

研究表明,榅桲果實從40～100 d，果肉的顏色越來越深，特別是落花后100 d，整個果肉變成了紅色，果肉中積累滿了木質素，此時木質素積累最多。而榅桲果實發(fā)育100～160 d，果肉顏色變淡，木質素積累量逐漸減少。榅桲木質素的積累主要在果肉部分積累，且越靠近果心部位積累越多。榅桲果實木質素的積累主要在發(fā)育前期(落花后100 d前)積累完成。圖5

注：蘋果(XP_028965477.1)、白梨(AKC35072.1)、枇杷(QCH01347.1)、櫻桃(XP_021816061.1)、桃(XP_007199637.1)、月季(XP_024165251.1)、胡桃(XP_018827699.1)、海島棉(PPR83915.1)、亞麻(DAC74029.1)、桑樹(XP_010096287.1)、煙草(NP_001312400.1)、擬南芥(NP_177412.1)
Note:apple(XP_028965477.1)、chinese pear(AKC35072.1)、loquat(QCH01347.1)、cherry(XP_021816061.1)、peach(XP_007199637.1)、rose(XP_024165251.1)、walnut(XP_018827699.1)、sea island cotton(PPR83915.1)、flax(DAC74029.1)、mulberry(XP_010096287.1)、tobacco(NP_001312400.1)、arabidopsis thaliana(NP_177412.1)

圖3 榅桲CAD基因同源性對比
Fig.3 Homology analysis forCADgene

表4 榅桲CAD基因編碼氨基酸的組成Table 4 The composition of amino acids of CAD

注：“target”代表克隆的榅桲CAD基因
Note：“target”representCADin this research

圖4 榅桲CAD基因的氨基酸序列比對與進化樹
Fig.4 Amino acid sequence allignment and phylogenetic tree analysis

注：紅色部分為木質素沉積結果
Note:The result of lignin accumulation in the red part

圖5 榅桲果實落花后40、70、100、130和160 d果肉間苯三酚木質素染色結果
Fig.5 Results of lignin staining between pulp 40, 70 , 100 , 130 and 160 days after fruit falling

2.5 榅桲CAD基因在果實發(fā)育時期的表達定量

研究表明,在果實發(fā)育的6個重要時期，CAD基因的表達在早期階段表達量較高，其后逐漸下降。10和40 d時的表達量最高，此時木質化程度最大。至70 d時其表達量是10 d時的2/3表達量，至130 d時表達量僅為10 d時的1/5。CAD基因的表達與果實木質化程度高度一致，木質素沉積越小，CAD表達量越低。圖6

圖6CAD基因在不同時期榅桲果實中的表達
Fig.6 Relative expression ofCADgene

3 討 論

與蘋果、梨等大宗水果相比榅桲果肉高度木質化，但其形成原因一直是空白，研究首次克隆得到了榅桲果實發(fā)育過程中調控木質素代謝的關鍵限速酶基因CAD基因，并采用生物信息學分析的方法探明了該基因的結構。研究中榅桲果肉組織中CAD基因的編碼區(qū)全序列區(qū)采用RT-PCR方法克隆獲得，測序得知其編碼區(qū)全序列由1 071 bp組成。依據(jù)序列同源性比對結果表明，該基因在物種間高度保守。榅桲CAD基因編碼326個氨基酸，CAD基因C端在不同的物種之間都有高度的結構同源性，N端的同源性較低。

對多物種的CAD基因序列進行同源性分析和系統(tǒng)進化分析，榅桲CAD基因與同為薔薇科的蘋果同源性相似度達96.63%，與白梨相似度達95.79%，聚為一類，而與擬南芥進化關系最遠，僅為43.59%的相似度，明確了該實驗克隆得到的cDNA序列是榅桲的CAD基因。同時也表明，植物同科之間CAD蛋白的進化過程非常保守，這與尹梅[16]在碭山酥梨上的研究結果一致。

發(fā)現(xiàn)了榅桲中CAD基因的表達規(guī)律與木質素的沉積密切相關。榅桲果實生長發(fā)育緩慢，生育期期長達160 d左右。通過木質素的間苯三酚染色發(fā)現(xiàn)，形成榅桲果肉木質化的關鍵時期在果實發(fā)育的前期，果實發(fā)育前100 h是木質素沉積的關鍵時期。而通過CAD的基因表達結果發(fā)現(xiàn)，CAD的基因表達量也是伴隨著幼果的形成和發(fā)育迅速升高，到40 d時達到最高值，以后緩慢降低。研究說明在榅桲果實發(fā)育早期，木質素合成快，木質化程度高，CAD基因表達量高。隨著木質素沉積速度的趨緩，CAD基因的表達量逐漸降低。CAD基因是調控榅桲果實木質化的關鍵基因。

4 結 論

榅桲CAD基因其開放閱讀框(ORF)序列為1 071 bp，編碼356個氨基酸，與其他物種序列同源性最高達96%，進化關系上與蘋果較近。榅桲果肉中CAD基因的表達與果實發(fā)育木質化程度高度相關，隨著木質素合成趨緩呈現(xiàn)一個逐步下調的趨勢。CAD基因是調控榅桲果實木質化的關鍵基因。