閆芳芳 徐傳濤 楊鵬

摘要 為了篩選出一株具有高毒力的蠟蚧輪枝菌菌株，根據(jù)已有文獻所記載的蠟蚧輪枝菌的培養(yǎng)條件，對一株蠟蚧輪枝菌菌株培養(yǎng)條件進行篩選，在不同接菌量、不同搖床轉(zhuǎn)速、不同碳源和氮源條件下，分別比較了各處理組蠟蚧輪枝菌的產(chǎn)孢數(shù)量。結(jié)果表明，在接菌量為1%的液體培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，同時在培養(yǎng)轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下菌株產(chǎn)孢量與其他搖床轉(zhuǎn)速處理差異顯著，產(chǎn)孢量為1.46×109個/mL，在第6天供試碳源為葡萄糖的處理產(chǎn)孢量為1.26×109個/mL。菌株在供試氮源為蛋白胨的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，為1.31×109個/mL，與供試氮源為酵母浸粉的處理之間差異顯著。在以上條件下，蠟蚧輪枝菌菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大和菌絲活力高等優(yōu)點，并為更好地將該菌應(yīng)用于大田生產(chǎn)提供了嶄新的思路。

關(guān)鍵詞 蠟蚧輪枝菌;初始接菌量;搖床轉(zhuǎn)速;碳源;氮源

Abstract In order to select one Verticillium lecanii with high virulence strains，based on the existing literature， the culture conditions of V.lecanii strain were screened. Under the conditions of different inoculation quantity，rotating speed of shaking bed，carbon source and introgen source，the sporulation quantity of V.lecannii in earch treatment was compared.The results showed that the spore amount in the liquid medium with the inoculation amount of 1% was the largest.At the same time，the spore yield of the strain was significantly different from that of other shaking bed treatments at the culture speed of 160 r/min.The spore yield was 1.46×109 spore/mL and the spore yield was 1.26×109 spore/mL at 6 d when the carbon source was glucose.The maximum spore yield of the strain in the medium with nitrogen source as protein was significant （1.31×109 spore/mL），which was significantly different from the treatment with nitrogen source as yeast extract.Under the above conditions，the strain had the advantages of rapid growth，large spore production and high fungus filiform vitality，and provided a new idea for better application of the strain in field production and application.

Key words Verticillium lecanii;Initial inoculation amount;Table speed;Carbon source;Nitrogen source

蠟蚧輪枝菌Verticillium lecanii被劃分為真菌界半知菌亞門淡色孢科輪枝孢屬[1]，廣泛分布于世界各地。主要寄生于同翅目昆蟲，其中包括葉蟬、蚜蟲、煙粉虱、粉蚧[2]等昆蟲。同時也寄生在一些侵染植物的病原菌上，如蠟蚧輪枝菌對煙草赤星病病原菌也具有一定拮抗作用，可以顯著抑制赤星病病斑的擴散，另外蠟蚧輪枝菌也可抑制包括銹病病原菌、線蟲、白粉病病原菌在內(nèi)的多種病原物。蠟蚧輪枝菌最早用于防治桃蚜[3]，防治效果較為理想。蠟蚧輪枝菌的代謝產(chǎn)物也對桃蚜等同翅目[4]刺吸式口器害蟲有防治作用[5]。

伴隨著化學(xué)農(nóng)藥的普及，人們在防治同翅目害蟲時首先使用化學(xué)藥劑，雖然一開始化學(xué)藥劑起到了藥到蟲滅短平快的效果，但藥劑防治的弊端也隨著時間的推移逐漸暴露出來，環(huán)境污染、農(nóng)業(yè)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量過高、害蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性、大范圍殺傷天敵等[6]。我國種植業(yè)也受到了很大沖擊，使得我國煙草、黃瓜和辣椒產(chǎn)量嚴(yán)重下降，每年所造成的經(jīng)濟損失巨大，國家財政收入受到嚴(yán)重影響。

目前生物防治方法已經(jīng)普遍為人們廣泛所接受，具有代表性的方法包括使用昆蟲病原菌防治害蟲以及利用天敵防治害蟲的方法，這些方法不但不會污染自然環(huán)境，而且對人類和牲畜沒有任何的毒害作用。蠟蚧輪枝菌就是這樣一種生物防治真菌，目前已經(jīng)有多個菌株商品化，市場上有多家公司生產(chǎn)銷售蠟蚧輪枝菌的菌株用于防治各種作物上的蟲害，是比較受大多數(shù)農(nóng)業(yè)勞動者歡迎的生物防治真菌。筆者以一株蠟蚧輪枝菌為研究對象，比較了該菌在不同接菌量、不同搖床轉(zhuǎn)速、不同碳源和不同氮源下的產(chǎn)孢情況，通過產(chǎn)孢量的大小，分析了該菌株的生長狀況與各培養(yǎng)條件參數(shù)的關(guān)系，以期得到對蚜蟲具有高致病毒力的蠟蚧輪枝菌菌株，為蠟蚧輪枝菌應(yīng)用于大田防治蚜蟲、煙粉虱等害蟲以及赤星病預(yù)防提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌種 供試蠟蚧輪枝菌菌株分離自四川省攀枝花市米易縣新山鄉(xiāng)煙葉試驗田中的罹患煙粉虱成蟲蟲體，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲病理實驗室分離保藏。試驗前，用接種環(huán)挑取一定量孢子接種到SDAY固體培養(yǎng)基上，在25 ℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，活化備用。

1.2 供試培養(yǎng)基 SDAY液體培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母浸粉1.0 g，純水100 mL。

1.3 最適接菌量的篩選 在無菌操作條件下，把培養(yǎng)7 d的蠟蚧輪枝菌接入SDAY液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在（26.0±0.5）℃、光周期12D∶12L、轉(zhuǎn)速120 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d，首次接菌后，經(jīng)過24 h再測算濃度，并將其以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%接菌量接入SDAY液體培養(yǎng)基中，每個接菌量重復(fù)3次，在恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)7 d，使用血球計數(shù)板測算孢子濃度。

1.4 最適搖床轉(zhuǎn)速的篩選 光周期定為12D∶12 L，溫度為（26.0±0.5） ℃，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為100、120、140、160、180 r/min，以1.0%接菌量接入SDAY液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7 d，每個搖床轉(zhuǎn)速重復(fù)3次，測定方法同“1.3”。

1.5 最適碳源及氮源的篩選 將SDAY培養(yǎng)基中葡萄糖分別用5種碳源（果糖、海藻糖、麥芽糖、木糖、山梨醇）替換使其含碳量相同，配制成6種不同碳源培養(yǎng)基;將SDAY培養(yǎng)基中蛋白胨分別用玉米漿、酵母浸粉、硝酸鈉3種氮源替換，使其含氮量相同。配制成4種不同的氮源培養(yǎng)基。培養(yǎng)及測定方法同“1.3”。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用DPS軟件和Excel軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌量對蠟蚧輪枝菌生長狀況的影響 由表1可知，在使用SDAY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的處理組中，接菌量為2%處理菌株產(chǎn)孢情況與接菌量3%的處理差異不顯著。接菌量4%的處理最大產(chǎn)孢量峰值出現(xiàn)在第6天，且最大產(chǎn)孢量與其他處理的最大產(chǎn)孢量差異顯著。3%和5%接菌量處理的峰值均出現(xiàn)在第6天，第7天產(chǎn)孢量均出現(xiàn)下降。

2.2 搖床轉(zhuǎn)速對蠟蚧輪枝菌生長狀況的影響

由表2可知，轉(zhuǎn)速100、120、140、160、180 r/min的條件下均可以生長并產(chǎn)孢。轉(zhuǎn)速在100～120 r/min時，轉(zhuǎn)速越高產(chǎn)孢量越大。在轉(zhuǎn)速為160～180 r/min條件下，菌株產(chǎn)孢量隨轉(zhuǎn)速增加而減少。蠟蚧輪枝菌菌株在5個搖床轉(zhuǎn)速條件下產(chǎn)孢量存在顯著差異。該菌株在160 r/min條件下生長速度最顯著，顯著高于100 r/min，產(chǎn)孢量最大，在第7天達到峰值，與其他4個處理之間差異顯著，其次是140、120、100和180 r/min，160 r/min為該菌株生長最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.3 碳源對蠟蚧輪枝菌生長狀況的影響

由表3可知，蠟蚧輪枝菌菌株在以葡萄糖[7]作為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，為1.25×109個/mL。海藻糖和麥芽糖之間差異不顯著。果糖的最大產(chǎn)孢量顯著低于其他5個處理產(chǎn)孢量的最大值，其最大產(chǎn)孢量出現(xiàn)在第6天，為9.19×108個/mL。海藻糖與木糖的最大產(chǎn)孢量均出現(xiàn)在第6天，二者最大產(chǎn)孢量之間差異不顯著。

2.4 氮源對蠟蚧輪枝菌生長狀況的影響

由表4可知，蠟蚧輪枝菌菌株在供試氮源為蛋白胨的液體培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，為1.31×109個/mL，與供試氮源為玉米漿之間差異顯著，其次是酵母浸粉和硝酸鈉。產(chǎn)孢量最低的處理為酵母浸粉，其最大產(chǎn)孢量為8.47×108個/mL，顯著低于供試氮源為蛋白胨的處理。玉米漿與硝酸鈉處理的最大產(chǎn)孢量差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，分離出的蠟蚧輪枝菌菌株的適應(yīng)能力強，搖床轉(zhuǎn)速、接菌量、碳源及氮源等培養(yǎng)條件均不同程度地影響菌株的產(chǎn)孢量及生長速率，這與李國霞等[8]研究結(jié)果相符。初始接菌量對蠟蚧輪枝菌的產(chǎn)孢量也有顯著影響，在SDAY液體培養(yǎng)基的處理組中，篩選出的供試菌株在接菌量5%的條件下的處理效果顯著，這說明初始接菌量與蠟蚧輪枝菌的活性及產(chǎn)孢量有關(guān)，這與王聯(lián)德等[9]的研究結(jié)果一致。

搖床轉(zhuǎn)速也在一定程度上影響菌株的產(chǎn)孢量，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min的處理菌株產(chǎn)孢量與其他處理差異顯著。而搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min的處理菌株產(chǎn)孢量顯著低于其他處理。碳源和氮源直接影響蠟蚧輪枝菌的生長狀況和產(chǎn)孢量。通常情況下，在培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌過程中選用的碳源一般是葡萄糖。該試驗結(jié)果表明，在接菌量相同的條件下，蠟蚧輪枝菌在供試碳源為葡萄糖處理中生長狀況顯著。這與高利[10]關(guān)于葡萄糖有利于蠟蚧輪枝菌生長的研究相符。在供試碳源為麥芽糖液體培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢量較顯著，第7天產(chǎn)孢量達1.06×109個/mL，這與張召榮等[11]的研究相符。在氮源培養(yǎng)基中，該菌株在蛋白胨中生長狀況較好，與菌株在玉米漿和硝酸鈉中生長有顯著差異，Mehta 等[12]的研究結(jié)果與該試驗結(jié)果相似。

關(guān)于蠟蚧輪枝菌的最適培養(yǎng)條件已經(jīng)有一些報道，綜合前人的報道，該試驗從供試培養(yǎng)基初始接菌量、搖床轉(zhuǎn)速、碳源和氮源4個方面進行研究。產(chǎn)孢量反映了蠟蚧輪枝菌菌株的生長狀況，產(chǎn)孢量越大，培養(yǎng)條件越適宜，菌株活性也越強。該試驗篩選出的各最適培養(yǎng)條件，均使蠟蚧輪枝菌表現(xiàn)出較強的活力和良好的培養(yǎng)性狀，說明以上培養(yǎng)條件可以使蠟蚧輪枝菌保持良好生長活性，該試驗結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。蠟蚧輪枝菌菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化在煙粉虱、蚜蟲等重要害蟲及赤星病等真菌性病害的生物防治上具有一定的應(yīng)用發(fā)展?jié)摿Α?/p>

參考文獻

[1] 蒲蟄龍，李增智.昆蟲真菌學(xué)[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1996：359-360.

[2] 方大琳.4株蠟蚧輪枝菌對扶桑綿粉蚧的致病力測定[J].福建林業(yè)，2018（1）：42-45，48.

[3] 羅小剛.一種重要的昆蟲病原真菌——蠟蚧輪枝菌V.lecanii[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1988（1）：57-64.

[4] 雷朝亮，榮秀蘭.普通昆蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：184-191.

[5] 陳吉棣.蠟蚧輪枝菌及其在生防中的應(yīng)用[J].生物防治通報，1985，1（4）：32-38.

[6] 周曉榕，高翔，王建國，等.營養(yǎng)和農(nóng)藥對蠟蚧輪枝菌生長發(fā)育的影響[J].植物保護，2006，32（5）：23-25.

[7] 劉春來，王爽，李新民，等.蠟蚧輪枝菌的碳·氮營養(yǎng)源研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（32）：12595-12596，12599.

[8] 李國霞，嚴(yán)毓驊，王麗英.溫度和營養(yǎng)對北京地區(qū)蠟蚧輪枝菌生長發(fā)育的影響[J].生物防治通報，1991，7（3）：115-119.

[9] 王聯(lián)德，王雪芹.蠟蚧輪枝菌對茶蚜的侵染模型[J].武夷科學(xué)，2011，27（00）：69-73.

[10] 高利.液體與固體培養(yǎng)幾種生防真菌的營養(yǎng)研究[J].中國生物防治，2009，25（4）：322-327.

[11] 張召榮，張艷軍，謝明.一株來自熱帶地區(qū)蠟蚧菌的鑒定、生物學(xué)特性及其對煙粉虱的致病力[J].中國生物防治學(xué)報，2015，31（1）：64-70.

[12] MEHTA J，KAUSHAL N，SEN P，et al.Impact of carbon & nitrongen sources on the Verticillium lecanii and Metarhizium anisopliaeEntomopathogenic fungi[J].European journal of experimental biology，2012，2（4）：1278-1283.