徐迪，黃青*

(1. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，中國科學(xué)院強(qiáng)磁場(chǎng)與離子束物理生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥 230026)

1 引言

微流控芯片又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a chip)，是一種在微米級(jí)尺度上實(shí)現(xiàn)操作微觀物體及分析微量樣品的技術(shù)。微流控芯片作為微全分析系統(tǒng)(micro total analysis systems,TAS)中最活躍的領(lǐng)域和發(fā)展前沿，其概念最早是于1990年由Manz提出[1]，他們以微機(jī)電加工技術(shù)(Microelectromechanical system, MEMS)作為建立TAS的技術(shù)基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一款微型化硅基開放式液相色譜儀器，將樣品預(yù)處理、分離及檢測(cè)功能集成于一張芯片上。微流控芯片的設(shè)計(jì)理念及最終目的就是將分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的微型化、集成化的芯片上，實(shí)現(xiàn)分析實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人化、家用化。自微流控芯片發(fā)展的二十年來，芯片的制作材料、加工技術(shù)、操控及檢測(cè)方法日漸成熟，在化學(xué)分析和化學(xué)合成等許多領(lǐng)域逐漸得到應(yīng)用[2]。微流控芯片系統(tǒng)最突出的優(yōu)勢(shì)在于樣品消耗少、反應(yīng)時(shí)間短，而對(duì)于稀少且易失活的生物樣品來說無疑是一種極好的分析工具。因此，近年來微流控芯片在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到格外重視[3]，如核酸測(cè)定[4]、蛋白質(zhì)檢測(cè)[5]、臨床診斷[6]、細(xì)胞分析[7]、藥物發(fā)現(xiàn)[8]等，另外在環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)、食品健康與安全檢測(cè)[9]等方面也顯示了良好的應(yīng)用前景。

微流控芯片與檢測(cè)器結(jié)合構(gòu)成微流控芯片分析系統(tǒng)，使得微流控芯片的研發(fā)及應(yīng)用不斷獲得發(fā)展。檢測(cè)器是整個(gè)分析系統(tǒng)中尤為關(guān)鍵的部分，其好壞直接關(guān)系到整個(gè)微流控芯片分析系統(tǒng)的性能，如檢測(cè)速度、樣品體積、檢出限及檢測(cè)范圍等。相對(duì)于傳統(tǒng)分析系統(tǒng)，微流控芯片由于具有特殊的微觀性狀如樣品體積小、檢測(cè)區(qū)域小、樣品流速快等，因此對(duì)檢測(cè)器的要求更加嚴(yán)格，如更高的靈敏度、更好的信噪比及更快的響應(yīng)速度；同時(shí)，檢測(cè)器的微型化和可集成性始終作為微流控分析的一個(gè)重點(diǎn)研究方向；此外，具有高通量的微流控芯片要求檢測(cè)器具備多重平行檢測(cè)功能[10]。現(xiàn)已用于微流控芯片上的檢測(cè)技術(shù)有電化學(xué)檢測(cè)[11]、質(zhì)譜分析[12]、光學(xué)檢測(cè)等。光學(xué)檢測(cè)器具有檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，其中與微流控芯片系統(tǒng)聯(lián)用的光學(xué)檢測(cè)器以熒光檢測(cè)器[13]、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器[14]、吸收光度檢測(cè)器[15]及拉曼散射檢測(cè)器[16]等為主。其中拉曼光譜檢測(cè)具有很多其他檢測(cè)技術(shù)難以達(dá)到的優(yōu)勢(shì)，首先它具有優(yōu)異的指紋識(shí)別能力，譜線銳利，可反映物質(zhì)分子的細(xì)微結(jié)構(gòu)變化；其次在樣品處理上也十分的簡便，所需樣品量少，對(duì)樣品的性質(zhì)和狀態(tài)無過多限制，有機(jī)、無機(jī)化學(xué)成分和生物材料均可檢測(cè)；另外拉曼光譜可對(duì)樣品進(jìn)行無接觸、無損傷檢測(cè)，光譜成像簡便、分辨率高、分析快速；而且拉曼光譜儀器體積適中、操作簡單，以上優(yōu)勢(shì)與微流控芯片的特征相容性程度很高。拉曼光譜與微流控芯片技術(shù)結(jié)合，可以準(zhǔn)確地且快速地監(jiān)測(cè)、檢測(cè)并分析微流控環(huán)境中的各種微小體積的生化樣品，特別是對(duì)于稀少且昂貴的生物樣品以及需要連續(xù)監(jiān)測(cè)的環(huán)境樣品等。目前拉曼微流控系統(tǒng)在單細(xì)胞分析尤其是在細(xì)胞分選上表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，與流式細(xì)胞術(shù)相比無需進(jìn)行標(biāo)記，芯片上流體操控更加精確，可實(shí)現(xiàn)在高速流動(dòng)狀態(tài)下單細(xì)胞的捕獲、拉曼光譜采集及自動(dòng)分離[17-18]。最近剛發(fā)表的關(guān)于自動(dòng)化拉曼光譜儀用于活細(xì)胞功能分選的工作[19]特別介紹了一個(gè)微流控光學(xué)平臺(tái)集成了微流體、光鑷和拉曼光譜技術(shù)，用于對(duì)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的微生物細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)化分類，適合于后續(xù)單細(xì)胞基因組學(xué)、微型宏基因組學(xué)的研究。

但普通拉曼光譜固有的缺點(diǎn)是信號(hào)極弱，其散射光強(qiáng)度約為入射光強(qiáng)度的10-6～ 10-9，拉曼光譜的應(yīng)用受到限制。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)的發(fā)現(xiàn)使這一狀況大為改觀[20]，即當(dāng)分子吸附于金或銀等貴金屬納米材料表面時(shí)，在電磁場(chǎng)增強(qiáng)及電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)下其拉曼信號(hào)可增強(qiáng)6～11個(gè)數(shù)量級(jí)[21]，靈敏度得到了質(zhì)的提升，單分子[22]及單細(xì)胞水平[23]檢測(cè)成為可能。所以，融合SERS檢測(cè)技術(shù)的微流控芯片可將拉曼微流控系統(tǒng)的分析水平和應(yīng)用范圍大大提高。實(shí)際上，近年來人們開始發(fā)展SERS與微流控系統(tǒng)相結(jié)合的技術(shù)，并在分析檢測(cè)方面已有十多年應(yīng)用和研發(fā)的歷史。Cooper團(tuán)隊(duì)[24]于2002年首次將SERS應(yīng)用到微流控芯片上，在微流體通道內(nèi)用硼氫化鈉還原硝酸銀的方法合成膠體銀作為流動(dòng)的SERS基底，膠體銀聚集形成間距小于10 nm的納米隙，在共振波長激發(fā)下，納米隙能產(chǎn)生一個(gè)顯著增強(qiáng)的電磁場(chǎng)，即所謂的“熱點(diǎn)”，熱點(diǎn)處的分子被激發(fā)得到增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。該系統(tǒng)可用于檢測(cè)低至10 fmol的偶氮染料，與宏觀流動(dòng)狀態(tài)下相比微流控芯片SERS檢測(cè)的靈敏度高出了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。隨后大量的相關(guān)工作被報(bào)道，盡管大多報(bào)道將SERS微流控平臺(tái)僅用于具有高散射界面的分子如羅丹明6G[25]、結(jié)晶紫[26]等的檢測(cè)，但人們很快將目標(biāo)集中在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域，利用SERS微流控技術(shù)，在諸如病原體鑒定[27]以及各種疾病的生物標(biāo)志物檢測(cè)[28]等方面開展了大量工作。

本綜述針對(duì)SERS微流控芯片近年來發(fā)展及在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究作了較為系統(tǒng)的介紹和論述。首先介紹SERS微流控芯片系統(tǒng)的核心部件——微流控芯片的制作和加工，以及如何在SERS微流控芯片上進(jìn)行流體操控，接著介紹了近年來微流控芯片中SERS基底的發(fā)展情況，隨后重點(diǎn)介紹和討論近年來SERS微流控芯片系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用及代表性或突破性工作，包括生物分子的檢測(cè)、細(xì)胞分析、藥物監(jiān)測(cè)和篩選、疾病診斷，以及關(guān)于環(huán)境衛(wèi)生和食品健康方面的檢測(cè)，最后對(duì)涉及該技術(shù)發(fā)展中的問題提出一些看法，對(duì)其未來的發(fā)展前景予以展望。

2 SERS微流控芯片系統(tǒng)

2.1 微流控芯片的制作

微流控芯片的制作材料從無機(jī)材料硅、玻璃及石英發(fā)展到現(xiàn)在使用最廣泛的有機(jī)聚合物如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，另外低成本的陶瓷材料以及新興的紙基材料也被用于微流控芯片的制作。硅由于具備良好的化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性，且作為微電子行業(yè)的基礎(chǔ)材料，其加工工藝及相關(guān)設(shè)備已相當(dāng)成熟，在TAS發(fā)展初期首先被用于制作微流控芯片(圖1a)[29]，但是由于硅材料自身的缺點(diǎn)如易碎、不透光、電絕緣性欠佳等，后來一度被玻璃和高聚物所取代。玻璃材料價(jià)廉易得、透光、耐腐蝕，且易構(gòu)建微結(jié)構(gòu)如微閥或微泵，由玻璃基底及其他材料復(fù)合形成的多路閥如圖1b所示[30]。石英芯片的透光性好，且拉曼背景低，適用于制作用于拉曼檢測(cè)的芯片。低溫共燒陶瓷(LTCC)是一種氧化鋁基材料，它在層壓板中形成圖案、完成組裝，然后在高溫下燒結(jié)形成芯片(圖1c)[31]。LTCC在制造復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)、多層結(jié)構(gòu)和低成本的微流控器件上有一定的優(yōu)勢(shì)。有機(jī)聚合物材料由于具有選擇空間大、易加工、價(jià)格低廉且可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于批量制作一次性微流控芯片，其中熱固性聚合物聚二甲基硅氧烷(PDMS)是當(dāng)前應(yīng)用最多的微流控芯片材料之一[32]。PDMS透氣透光、無毒、成本低廉、化學(xué)惰性、制作快捷，具有特殊的彈性易于加工微型控制結(jié)構(gòu)，另外通過疊合多層PDMS可制作復(fù)雜結(jié)構(gòu)功能化芯片(圖1d)[33]。Whitesides等于20世紀(jì)90年代末期采用了軟光刻方法制作微流控芯片[34]，此后PDMS和軟光刻法被推廣開來，成為實(shí)驗(yàn)室普遍采用的芯片制作材料和方法。凝膠材料具備良好的透過性以及生物相容性，主要應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)及組織工程的研究中(圖1e)[35]。新提出的紙基芯片處于高速發(fā)展的階段，其來源豐富、成本低廉、便攜性好，具有良好的生物相容性，且廢棄后易處理，引起了科研人員的廣泛關(guān)注。第一例紙基微流控芯片是由Whitesides團(tuán)隊(duì)于2007年報(bào)道[36]，該芯片上的液體是在毛細(xì)作用下實(shí)現(xiàn)被動(dòng)運(yùn)輸，無需外接驅(qū)動(dòng)裝置，如圖1f所示。紙基芯片適合于需要成本低且操作簡單的快速分析，其推動(dòng)了便攜式分析設(shè)備在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[37]。

圖1 不同材料制作的芯片。(a)硅[29]；(b)玻璃[30]；(c)陶瓷[31]；(d)PDMS[33]；(e)凝膠[35]；(f)紙[36]

Fig 1 Microfluidic chips fabricated by different materials: (a) silicon[29]; (b) glass[30];(c) ceramic[31]; (d) PDMS[33]; (e) gel[35]; (f) paper[36]

硅片、玻璃和石英芯片的制作方法一般采用成熟的微細(xì)加工技術(shù)，即半導(dǎo)體及集成電路芯片廣泛使用的光刻和蝕刻技術(shù)。芯片制作過程主要包括薄膜沉積、光刻和蝕刻三個(gè)工序。薄膜沉積是通過熱氧化、化學(xué)氣相沉積、氣相外延、物理氣相沉積、涂敷、濺射等方法在基片表面覆蓋一層薄膜，薄膜作為犧牲層，提高了刻蝕時(shí)的選擇性，起到對(duì)基片的保護(hù)作用。光刻和蝕刻技術(shù)是將掩模上設(shè)計(jì)的微流控芯片圖案通過曝光成像轉(zhuǎn)移到薄膜上并進(jìn)而在基片上加工成特定微結(jié)構(gòu)的工藝。有機(jī)聚合物芯片的制作則與無機(jī)材料芯片有很大的區(qū)別，可采用的制作技術(shù)有傳統(tǒng)的模塑法、注塑法、熱壓法，或激光燒蝕法、LIGA(X射線光刻、微電鑄與微復(fù)制)、軟光刻以及新興的3D打印法等。激光燒蝕法[38]是一種新型微細(xì)加工技術(shù)，利用可光解聚合物在紫外激光作用下發(fā)生激光濺射，采用掩?；蛑苯痈鶕?jù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)精密控制濺射位置，從而得到具有特定結(jié)構(gòu)的芯片。激光燒蝕得到的微流控芯片通道壁垂直、深寬比大，但加工效率低，激光器昂貴且具有一定的危險(xiǎn)性。LIGA[39]是一種基于X光深層光刻、微電鑄和微復(fù)制的MEMS加工技術(shù)，近來已用于制作熱壓法和注塑法所需的模具及高深寬比的聚合物芯片。軟光刻是20世紀(jì)90年代末提出的一種新的微圖形復(fù)制技術(shù)，它的研發(fā)及在PDMS材料的大規(guī)模應(yīng)用是微流控芯片發(fā)展史上一個(gè)重要的里程碑。該技術(shù)用彈性介質(zhì)代替了傳統(tǒng)光刻中使用的硬模，多數(shù)條件下用PDMS，利用這種彈性介質(zhì)進(jìn)行簡便而又精確的復(fù)制，從而提高了微制作的效率。另外，軟光刻技術(shù)能在曲面上操作，可制造復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)，相對(duì)于傳統(tǒng)光刻應(yīng)用更加靈活。軟光刻技術(shù)沒有光散射引起的精度限制，可以達(dá)到30 nm～1m的微結(jié)構(gòu)尺寸。近年來，3D打印法在分辨率和速度方面的提升使微流控器件的制作過程直接簡化為一步，是最有可能將芯片推向商業(yè)化的一項(xiàng)制作技術(shù)[40]。與傳統(tǒng)方法相比，除了高速和高分辨率，3D打印在制造微流控器件方面還有其他顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括適用材料廣、可制造特殊的孔結(jié)構(gòu)，甚至可將將多孔的組織支架嵌入到芯片。另外，生物材料如活細(xì)胞和生長因子，可以直接用3D打印機(jī)打印[41]。

圖2 微通道構(gòu)型被動(dòng)混合器。(a)微柱陣列[46]；(b)鱷魚齒狀[47]；(c)級(jí)聯(lián)分裂重組[44]；(d)多通道交替混合[43]

Fig 2 Passive micromixers based on designed microfluidic channels such as (a) a pillar array microfluidic channel[46]; (b)an alligator teeth-shaped microfluidic channel[47]; (c)the cascaded splitting and recombination (C-SAR) microfluidic mixer[44]; (d)multiple channels for fast and alternating mixing[43]

2.2 SERS微流控芯片上的流體操控

微流控芯片在SERS測(cè)量之前主要用于特定樣品的預(yù)處理[42]，控制目標(biāo)分析物與金屬納米材料之間的混合[43]，另外控制納米粒子間距以增強(qiáng)SERS信號(hào)[44]，通過流體操控捕獲樣品制造小體積、高濃度樣品，以便從目標(biāo)物中獲得詳細(xì)的拉曼光譜信息[45]。如何實(shí)現(xiàn)微流控芯片上對(duì)流體的精密操控，為完成后續(xù)光譜分析提供保障，以充分利用SERS系統(tǒng)的高靈敏度和高選擇性，這就需要芯片上各種微結(jié)構(gòu)的配合使用如微泵、微閥、微混合器等，對(duì)微流體環(huán)境進(jìn)行精準(zhǔn)有效的控制。以微結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)建立的各個(gè)功能化的模塊，可以對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行預(yù)處理，如分離、富集、捕獲等，從而提高SERS微流控系統(tǒng)的分析能力。

SERS檢測(cè)要求目標(biāo)分析物與SERS基底即納米材料的充分混合，所以微流控通道的設(shè)計(jì)或微混合器的使用十分重要。在微流控通道中，微米尺度下的流體均以低雷諾數(shù)的層流形式流動(dòng)，分子只能通過擴(kuò)散進(jìn)行混合。為了混合充分，目前使用較多的是根據(jù)微流體力學(xué)原理設(shè)計(jì)復(fù)雜的通道構(gòu)型以提高混合效率，減小混合所需的時(shí)間和空間，如微柱陣列[46]、鱷魚齒狀[47]、 級(jí)聯(lián)分裂重組[44]及多交替通道微混合器[43]等(圖2)。另外，SERS微流控系統(tǒng)中已經(jīng)報(bào)道的主動(dòng)混合器有電動(dòng)[48]及磁力攪拌[28]混合器，另外氣泡誘導(dǎo)[49]、聲波驅(qū)動(dòng)[50]等混合器具有應(yīng)用潛力。主動(dòng)混合器可以實(shí)現(xiàn)良好的混合，但相對(duì)于被動(dòng)微混合器來說成本高、集成難，通常需要復(fù)雜的控制單元和外部驅(qū)動(dòng)等。

另外，生物樣品的復(fù)雜性對(duì)目標(biāo)分子SERS光譜分析帶來一定的干擾，所以樣品預(yù)處理技術(shù)在SERS微流控系統(tǒng)研發(fā)和應(yīng)用中也十分關(guān)鍵。SERS微流控系統(tǒng)常采用芯片毛細(xì)管電泳對(duì)復(fù)雜樣品中的多種組分進(jìn)行高速分離，Schultz等[51]設(shè)計(jì)的毛細(xì)管電泳SERS芯片中毛細(xì)管附著在鞘流界面上，用于分離后的流體分析物的連續(xù)流動(dòng)和聚焦，并將其準(zhǔn)確引入SERS基底上，該裝置已用于氨基酸[52]及多肽[53]等的高效分離。Perozziello等[54]將微滲析膜安裝在微流控芯片中，可以在樣品到達(dá)SERS基底之前從較大的蛋白質(zhì)中分離出較小的蛋白質(zhì)或其他小分子。Kong等[55]采用由高度多孔的硅藻土作為微流體通道的材料，將色譜分離集成在芯片通道內(nèi)，利用該裝置從混合物或復(fù)雜生物流體中分離小分子。Durucan等[56]結(jié)合了離心力和毛細(xì)作用力在SERS襯底上進(jìn)行樣品的分離純化，即快速、簡便地提取牛奶中的三聚氰胺。Au NP陣列阻礙了大分子的擴(kuò)散，離心下的慣性力加速了過濾過程，小分子擴(kuò)散到相對(duì)純凈的環(huán)境中。Morelli,等[42]介紹了一種集過濾、液液萃取和檢測(cè)SERS傳感器于一體的離心式微流控自動(dòng)化平臺(tái)，用于檢測(cè)大腸桿菌的次生代謝物---對(duì)香豆酸，并可能適用于其他次級(jí)代謝物如抗生素、維生素和藥物的提取和檢測(cè)。集成在芯片內(nèi)的醋酸纖維素膜用于過濾細(xì)胞，萃取室與裝載二氯甲烷的腔室及導(dǎo)入過濾后樣品的蛇形虹吸管相連，蛇形虹吸管分裂成四個(gè)通道連接在萃取室底部，以產(chǎn)生氣泡提高混合和萃取效率，萃取后的樣品直接通入檢測(cè)室獲取SERS圖譜。

2.3 微流控芯片中的SERS材料或基底

SERS通常采用由Ag、Au、Cu等金屬納米材料作為SERS活性基底，增強(qiáng)原理目前可以分為電磁場(chǎng)增強(qiáng)(EM)及化學(xué)增強(qiáng)(CE)[21]。SERS光譜強(qiáng)度可通過以下公式近似表示[57]：

(1)

(2)

式中GEM為EM增強(qiáng)因子，A(νL)和A(νs)分別為激光和拉曼散射場(chǎng)的增強(qiáng)因子，ε0為周圍介質(zhì)的介電常數(shù)，ε(ν)為金屬納米材料的介電函數(shù)，d為分析物和金屬納米材料的距離，和項(xiàng)(αρσ)nm為CE增強(qiáng)因子。同時(shí)將EM和CM結(jié)合是SERS實(shí)現(xiàn)超痕量檢測(cè)的關(guān)鍵，其靈敏度可與熒光光譜相媲美[58]。盡管作用機(jī)制不同，二者均受到SERS活性基底即納米材料的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)影響。

關(guān)于SERS熱點(diǎn)構(gòu)建，主要基于EM機(jī)制設(shè)計(jì)各種納米尺度形狀的材料和平臺(tái)，從單個(gè)粒子發(fā)展到復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，也將設(shè)計(jì)理念從最初的創(chuàng)造具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征以提高單個(gè)粒子的熱點(diǎn)密度，發(fā)展到利用多維等離子體耦合來顯著提高熱點(diǎn)強(qiáng)度。在單個(gè)粒子形狀的設(shè)計(jì)上，主要利用大曲率結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的“避雷針效應(yīng)”以獲得較高的電磁場(chǎng)增強(qiáng)，例如Au和Ag納米球[59]、納米棒[60]、納米錐[61]、納米星[62]、花狀[63]等結(jié)構(gòu)的納米粒子，他們因具有納米尺度的尖角、脊、溝槽、尖端或粒子內(nèi)間隙表現(xiàn)出強(qiáng)烈的SERS活性。除了直接合成復(fù)雜的納米粒子形貌外，還可以通過對(duì)合成后的納米粒子進(jìn)行形態(tài)修飾，如在納米銀八面體的邊緣及尖端區(qū)域選擇性沉積Au納米粒子[64]，或者將原先合成的材料刻蝕掉一部分，如通過化學(xué)刻蝕增加Ag納米顆粒的粗糙度以提高熱點(diǎn)EM增強(qiáng)效應(yīng)[65]。第二種SERS熱點(diǎn)產(chǎn)生于耦合納米結(jié)構(gòu)的可控的粒子間納米間隙，典型的例子是Au或Ag 納米粒子二聚體，用于SERS 單分子檢測(cè)，以及核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體、納米粒子聚集體或寡聚體及納米粒子陣列等。通常，耦合等離子體納米結(jié)構(gòu)的平均SERS強(qiáng)度比單個(gè)納米結(jié)構(gòu)的平均SERS強(qiáng)度高出四個(gè)數(shù)量級(jí)[66]。三維結(jié)構(gòu)的納米材料的引入不僅能使吸附和檢測(cè)到的目標(biāo)分子更多，而且有效提高了熱點(diǎn)的數(shù)量及其在Z方向上的利用率。目前3D SERS平臺(tái)的制造策略主要分為自上而下和自下而上兩種。自下而上是通過納米顆粒自組裝形成各種大面積三維結(jié)構(gòu)和緊密堆積的超晶體[67]。而自上而下是采用傳統(tǒng)的微加工方法(如光刻、反應(yīng)離子刻蝕等)來設(shè)計(jì)納米器件[68，69]，目前自上而下的制造技術(shù)在精度方面受到著如電子束光刻的空間分辨率限制，難以重復(fù)制作粒子間間隙小于10 nm的陣列結(jié)構(gòu)。為了克服這一限制，研究者提出將自上向下與納米顆粒自組裝結(jié)合起來制造具有納米級(jí)粒子間隙的3D SERS基底的方法，即由模板引導(dǎo)的納米顆?；瘜W(xué)自組裝[70]。

圖3 金屬膠體在微流控通道中的可控聚集。(a-b)介電泳驅(qū)動(dòng)力按需捕獲并釋放銀納米顆粒[78]；(c)光電鑷子聚集金納米粒子于激光光斑內(nèi)[79]；(d)磁聚焦納米顆粒[81]:金包覆NiFe磁性納米粒子NiFe@Au，Ab1捕獲抗體，Ab2檢測(cè)抗體，RL拉曼標(biāo)記分子，腫瘤生物標(biāo)志物CEA

Fig 3 The controllable aggregation of SERS-active nanoparticles in the microfluidic channel. (a-b)Dielectrophoretic actuation[78]for on-demand nanoparticle aggregation and release; (c)optoelectronic tweezer for accumulating gold nanoparticles in a laser spot[79]; (d)magnetic focusing realized by functional nanoprobes(NiFe@Au), capture antibody(Ab1), detection antibody(Ab2), and Raman label (RL)[81]

以上金屬納米材料的SERS熱點(diǎn)只通過電磁場(chǎng)增強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)，為了進(jìn)一步提高熱點(diǎn)增強(qiáng)效應(yīng)，一些功能材料如石墨烯[71]、半導(dǎo)體[72]和壓電聚合物[73]等被引入，它們與傳統(tǒng)的SERS活性金屬納米材料結(jié)合形成復(fù)合材料產(chǎn)生新型SERS基底。這些材料可以提供額外的化學(xué)或電場(chǎng)增強(qiáng)，與金屬納米粒子產(chǎn)生的電磁增強(qiáng)相互補(bǔ)充，在原有的基礎(chǔ)上提升10～102倍。此外，復(fù)合的SERS基底結(jié)合了這兩種材料的固有特性，克服了傳統(tǒng)的純貴金屬SERS基底的局限性，如增強(qiáng)了材料表面與分析物的親和力，提高了穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。除了提高SERS基底的熱點(diǎn)強(qiáng)度外，另一種提高SERS信號(hào)的方法是增強(qiáng)目標(biāo)分子的捕獲率，該操作可進(jìn)一步將SERS性能提高10-104倍。分子捕獲旨在通過各種途徑提高SERS活性位點(diǎn)的局部分析物濃度，特別是對(duì)于與材料表面沒有親和力的分子。

一般說來，被測(cè)樣品的拉曼信號(hào)增強(qiáng)可以從三個(gè)方面考慮：擴(kuò)大分子拉曼截面[74]、在材料表面通過化學(xué)修飾捕獲分子[75]、以及用物理方法將分析物直接限制在SERS-活性表面[76]。如何將以上多種高質(zhì)量的SERS基底應(yīng)用到微流控通道中是構(gòu)建SERS微流控系統(tǒng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)?？傮w來說微流控通道中的SERS基底可以分為兩類：金屬膠體和固態(tài)基底?；诮饘倌z體的SERS基底合成及使用方法簡單方便，首個(gè)SERS微流控系統(tǒng)就是以膠體銀作為流動(dòng)的SERS基底[24]，膠體銀通過硼氫化鈉還原硝酸銀的方法在微流體通道內(nèi)原位合成，或可預(yù)先合成金屬膠體然后直接注入微流控通道以進(jìn)行后續(xù)的SERS檢測(cè)[47]。金屬膠體的合成依賴于帶電表面活性劑作為穩(wěn)定劑和分散劑，離子環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致膠體聚集，這種隨機(jī)不可控的聚集導(dǎo)致電磁場(chǎng)增強(qiáng)分布不均，引起信號(hào)不均、重現(xiàn)性差的問題需得到解決。近年來關(guān)于金屬膠體的在微流控通道中可控聚集的研究工作取得了一定的進(jìn)展。介電泳在微流控裝置中被廣泛應(yīng)用于粒子和細(xì)胞的操縱、分選和捕獲，其是指極化粒子在電場(chǎng)梯度中的遷移。Chrimes等利用介電泳控制銀納米粒子在通道中的聚集及間距，有效地提高SERS活性熱點(diǎn)的數(shù)量，同時(shí)避免粒子的不可逆聚集[77]。Salemmilani等[78]采用介電泳技術(shù)，高度局部地按需捕獲并釋放銀納米顆粒，如圖3a和3b所示，裝置包括夾在電極基板和頂蓋之間的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道，通道出口處的真空泵用于建立負(fù)壓引起流體流動(dòng)。在電極接觸墊上施加交流電位以激活介電泳納米粒子捕獲陷阱。銀納米粒子與分析物預(yù)混合，在陷阱區(qū)團(tuán)聚形成SERS熱點(diǎn)，然后利用拉曼顯微鏡掃描陷阱區(qū)獲得光譜。研究者利用光電鑷子[79]將金納米粒子聚集在激光光斑內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SERS信號(hào)的原位增強(qiáng)和測(cè)量，如圖3c所示。通過光誘導(dǎo)電動(dòng)機(jī)理使分散在樣品溶液中的金納米粒子集中到激光光斑中并激發(fā)拉曼散射，實(shí)現(xiàn)了按需產(chǎn)生SERS活性位點(diǎn)及原位測(cè)量SERS信號(hào)。除了采用光電，磁場(chǎng)也可用于控制納米粒子聚集。研究者利用免疫反應(yīng)將表面修飾有抗原的金納米顆粒與負(fù)載有相應(yīng)抗體的磁珠結(jié)合，通道中固定的螺線管通電后產(chǎn)生的磁場(chǎng)用于捕獲上述免疫復(fù)合物，SERS檢測(cè)信號(hào)與待測(cè)物中抗原的含量成負(fù)相關(guān)[80]。另外還可以采用磁性物質(zhì)如鎳鐵與貴金屬形成的核殼型納米材料作為SERS活性基底，直接通過磁場(chǎng)進(jìn)行控制[81](圖3d)。在生物免疫結(jié)合作用下，納米探針被磁聚焦在微流控通道中的一個(gè)特定點(diǎn)上，從而能夠富集“熱點(diǎn)”，用于對(duì)靶向的癌胚抗原進(jìn)行SERS檢測(cè)。除了以上外部施加的主動(dòng)驅(qū)動(dòng)力，通道內(nèi)部的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可在特定位置提供毛細(xì)管力直接用作納米粒子的聚集點(diǎn)[82]。如在一個(gè)縮窄的、臺(tái)階式的微通道-納米通道結(jié)處，由于通道面積突然減小，大量納米粒子團(tuán)聚在此，電磁增強(qiáng)因子達(dá)到108，同時(shí)目標(biāo)分子也集中在此處，SERS信號(hào)得以大幅度提升。

基于金屬膠體的SERS微流控系統(tǒng)可以提供可控的流動(dòng)檢測(cè)條件，使信號(hào)差異平均化，減少局部升溫，從而提高檢測(cè)重復(fù)性。但存在的問題是分析物與金屬納米顆?；旌系臅r(shí)間較長，且不易混合均勻，甚至堵塞通道。在固態(tài)SERS基底中，這些問題是可以避免的，因?yàn)镾ERS基片不會(huì)隨分析物流動(dòng)。此外，為了產(chǎn)生均勻的熱點(diǎn)陣列，固態(tài)SERS襯底需精確控制納米間隙，這是獲得電磁場(chǎng)增強(qiáng)和高重現(xiàn)性所必需的。在微流控芯片中嵌入固態(tài)SERS基底主要可以通過兩種方式實(shí)現(xiàn)，一種是在微流控通道內(nèi)原位制備SERS活性金屬納米結(jié)構(gòu)，另一種是在固態(tài)SERS基底上構(gòu)建微流控通道。在芯片中原位制備固態(tài)SERS基底，如采用多元醇還原法原位制備納米Ag薄膜，該方法簡單方便且成本低[83]，制備過程及表征如圖4所示。將以硅片為襯底的PDMS通道加熱至150℃并注入Ag前驅(qū)體。前驅(qū)體中的Ag+被還原成核，在一定的Ag+濃度條件下，Ag核生長為Ag納米粒子并在襯底和PDMS通道的表面形成Ag薄膜。圖案化Ag薄膜的SERS增強(qiáng)系數(shù)為4.25×1010，用于實(shí)時(shí)傳感檢測(cè)。電偶置換法可在室溫下進(jìn)行，如將銀納米顆粒原位電沉積在粗糙Cu核/C鞘層納米壁上，在通道內(nèi)形成高活性拉曼基底[84]。在該方法中，電極必須集成到微流控通道中，納米銀的沉積形狀和位點(diǎn)可通過預(yù)先圖案化的電極來控制。納米銀沉積的的納米壁具有很大吸附的面積，以及大量的SERS熱點(diǎn)，計(jì)算的表觀增強(qiáng)因子高達(dá)1.1×109。該方法為在微流控通道內(nèi)集成SERS活性基底開辟了新的途徑。另外有研究者提出通過光熱效應(yīng)在芯片中原位生長負(fù)載Ag NP的ZnO納米棒(Ag@ZnO)3D SERS基底[85]。飛秒激光直寫技術(shù)以其獨(dú)特的設(shè)計(jì)性和可控性，被認(rèn)為是制備光聚合物微納結(jié)構(gòu)的一種強(qiáng)有力的方法。Xu等利用飛秒激光誘導(dǎo)銀離子光還原，在微流控通道內(nèi)原位合成銀納米花陣列基底[86]，該微通道被用作實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的催化微反應(yīng)器。

圖4 (a)多元醇還原法原位制備納米Ag薄膜流程圖；(b)通道中Ag薄膜的SEM圖像；(c)Ag薄膜PDMS通道；(d)Ag薄膜硅片[83]

Fig 4 (a) In-situ fabrication Ag thin films by a polyol method; (b) SEM image of the Ag thin film in a channel; (c) a PDMS channel and (d) a Si wafer patterned with Ag thin films[83]

除了上述的在芯片上原位合成固態(tài)SERS基底，還可以預(yù)先制備好圖案化的固態(tài)SERS基底，再在基底上構(gòu)建微流控通道。最典型方法是采用光刻法制備固態(tài)SERS基底，以Choo團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的金陣列為例[87]，他們選用玻璃片為最底層，依次濺射鈦和金膜，再旋凃光刻膠，與傳統(tǒng)的掩模曝光不同的是他們采用的是UV定位曝光，顯影刻蝕后獲得特定圖案的金微陣列。用于SERS基底的理想納米制造技術(shù)需能夠產(chǎn)生尺寸只有幾十納米、同時(shí)間隔只有幾納米的金屬結(jié)構(gòu)，該方法獲得金微陣列的仍達(dá)不到該條件。一個(gè)芯片往往需要多種技術(shù)的結(jié)合才能完整的制備出來，芯片是基于軟光刻、金屬沉積后選擇性圖案化及氧等離子體處理制備而成[88]。在帶有微流控通道的PDMS板上熱蒸發(fā)一層薄銀膜，用膠帶將微流控通道外表面的銀膜簡單而有選擇地去除。氧等離子體處理同時(shí)使納米表面形成高強(qiáng)度SERS活性的納米尖端或納米點(diǎn)，并使PDMS與玻璃基板永久結(jié)合。Han等[89]采用激光刻劃法制備銀納米粒子(AgNPs)氧化石墨烯(GO)的SERS復(fù)合基底，通過編程直接形成圖案，再將其轉(zhuǎn)移至PDMS上，再與另一片PDMS封合制成芯片(圖5)。激光刻劃法屬于連續(xù)激光直寫法，采用的是780 nm聚焦近紅外激光器(200 mW)對(duì)DVD光盤進(jìn)行劃刻。DVD可被編寫特定程序，并可用于大面積、快速和無掩模的GO還原(RGO)，只需20分鐘就可以完成整個(gè)DVD光盤的圖案制作。作為投入實(shí)際應(yīng)用的要求，這些技術(shù)應(yīng)該具有一些突出的特點(diǎn)，包括低成本的制造、大面積的圖案化及良好的重現(xiàn)性等。

Zhou等[90]開發(fā)了一種不同于上述兩種構(gòu)建微流控固態(tài)SERS基底的方案，他們是將制備好的線狀基底直接插入玻璃毛細(xì)管中。該線狀基底是一條電熱康銅絲，其表面覆蓋修飾有Ag納米顆粒(Ag-NP)的垂直排列的ZnO納米錐(ZnO-NT)。隨后，溫敏微凝膠、金納米棒膠體和分析物組成的混合物被填充到毛細(xì)管的剩余空間中，通過電路開合控制溫度，溫敏微凝膠遇熱收縮，使得待測(cè)物和Au納米棒相互接近，且更接近Ag-ZnO納米錐。該3D固態(tài)基底產(chǎn)生高密度的SERS“熱點(diǎn)”，并被應(yīng)用于湖水中甲基對(duì)硫磷的測(cè)定。

圖5 激光刻劃法制備AgNPs@RGO SERS微流控芯片。(a)AgNPs@RGO芯片制作過程示意圖；(b)紫外光照射下石墨烯片上Ag NPs的生長機(jī)理；(c)各種AgNPs@RGO SERS襯底的可編程圖案(標(biāo)尺：500m)；(d)制備的AgNPs@RGO芯片的照片(標(biāo)尺：1 cm)[89]

Fig 5 Fabrication of AgNPs@RGO SERS microfluidic chip by direct laser scribing. (a) Fabrication procedures; (b) growth mechanism of AgNPs on graphene sheets under UV irradiation; (c) various programmable patterning of AgNPs@RGO SERS substrates (scale bar: 500m); (d) the as-prepared AgNPs@RGO SERS microfluidic chip (scale bar: 1cm)[89]

3 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

伴隨著微工藝加工技術(shù)的發(fā)展以及生物醫(yī)學(xué)研究對(duì)生物樣品組分分離分析的高精度需求，近十幾年來微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3]。微流控芯片最大的特征是微型化，從而具備樣品消耗少，分離分析速度快、通量高、液體流動(dòng)可控、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)勢(shì)。微流控芯片具有靈活的集成性，多個(gè)微腔室可同時(shí)實(shí)施不同的功能，如在一塊芯片上可以完成對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)、分選、識(shí)別和分析等一系列精準(zhǔn)操作[91]。SERS在痕量檢測(cè)上具有超高靈敏度以及快速無損檢測(cè)的特點(diǎn)，同時(shí)固有的拉曼特征峰半峰寬窄，特異性強(qiáng)，易于區(qū)分。將SERS與微流控相結(jié)合，一方面在極少液態(tài)樣品的檢測(cè)上提高了SERS穩(wěn)定性和重復(fù)性，另一方面也拓展了微流控芯片的使用領(lǐng)域，特別是在生物分子的檢測(cè)、細(xì)胞分析、藥物篩選和開發(fā)、疾病診斷、環(huán)境健康及食品衛(wèi)生檢測(cè)等均已有相當(dāng)出色的應(yīng)用。

圖6 電池控制的SERS微流控系統(tǒng)的示意圖和表征圖。(a)電池控制的SERS微流控系統(tǒng)；(b)康銅線電鍍ZnO納米錐SEM圖；除去部分ZnO納米錐后的康銅線SEM圖(c)和近觀圖(d)[90]

Figure 6 Schematic illustration of the battery-controlled SERS microfluidic system and characterizations. (a)The battery-controlled SERS microfluidic system; (b)a SEM image of the constantan wire electrodeposited with ZnO nanotapers(ZnO-NTs); (c) a SEM image and (d) a close-up view of ZnO-NTs covered constantan wire after partial ZnO-NTs being removed[90]

3.1 生物分子檢測(cè)

生物分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，有利于臨床及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)步。SERS微流控系統(tǒng)具備無損、超靈敏檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，已成功地應(yīng)用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)等生物分子的檢測(cè)。

DNA分子需要一種快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，在DNA微陣列芯片技術(shù)中，由于DNA的濃度很低，在檢測(cè)之前應(yīng)使用PCR技術(shù)對(duì)DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，再用微陣列測(cè)定機(jī)將樣品固定在滑動(dòng)玻璃上，最后用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法對(duì)放大信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。Park等[92]采用共焦表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)，對(duì)PDMS微流控通道中染料標(biāo)記的雙鏈DNA寡核苷酸進(jìn)行了快速、高靈敏的檢測(cè)，檢測(cè)濃度可低至10-11M。與DNA微陣列芯片相比，這種方法既不需要固定的程序，也不需要PCR擴(kuò)增。此外，相對(duì)于熒光或化學(xué)發(fā)光信號(hào)，每個(gè)染料標(biāo)記的DNA的特征拉曼峰很容易分辨。準(zhǔn)確、靈敏地識(shí)別腫瘤細(xì)胞DNA突變對(duì)腫瘤的診斷、預(yù)后及個(gè)體化治療至關(guān)重要，Huh等[93]將電動(dòng)驅(qū)動(dòng)的微流控裝置與SERS結(jié)合(圖7)，采用連接酶檢測(cè)反應(yīng)法(LDR)檢測(cè)人KRAS癌基因的點(diǎn)突變。在LDR中有兩個(gè)引物，上游引物含有SERS活性染料和識(shí)別目標(biāo)DNA的3’端堿基，而下游引物連接著銀納米顆粒。當(dāng)這兩個(gè)引物與模板DNA完全匹配的情況下，即連接在一起時(shí)，染料被帶到靠近納米粒子的地方，其特征拉曼峰可以被檢測(cè)到。電動(dòng)驅(qū)動(dòng)的微阱裝置將反應(yīng)產(chǎn)物濃縮在一個(gè)有限的體積中以增強(qiáng)光學(xué)信號(hào)，對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)限低至20 pM。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也被用于SERS微流控系統(tǒng)中KRAS癌基因的點(diǎn)突變檢測(cè)[94]，在40分鐘內(nèi)區(qū)分癌細(xì)胞多種核酸中突變型和野生型KRAS基因。SERS微流控技術(shù)的結(jié)合使得DNA無標(biāo)記檢測(cè)成為可能。核酸典型堿基的化學(xué)修飾在增加遺傳多樣性和編碼生物信息方面起著重要作用，Morla‐Folch等[95]應(yīng)用SERS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)單鏈和雙鏈DNA中4種不同修飾的胞嘧啶的鑒別和相對(duì)定量。SERS檢測(cè)和微流控技術(shù)的結(jié)合消除了預(yù)擴(kuò)增或富集步驟的需要，實(shí)現(xiàn)了對(duì)pg級(jí)DNA樣品進(jìn)行超靈敏分析，這為DNA實(shí)時(shí)的自動(dòng)篩選提供了一種簡單的低成本設(shè)備。為了克服微流控芯片中液體通過層流擴(kuò)散導(dǎo)致檢測(cè)效率低、芯片重復(fù)利用的交叉污染等問題，Han等[89]介紹的激光刻劃方法制備的AgNPs@RGO生物芯片，作為一種可重復(fù)使用的SERS微流控傳感器進(jìn)行DNA檢測(cè)。DNA和石墨烯之間的非共價(jià)相互作用介導(dǎo)了DNA序列的可控捕獲和釋放，從而有效地實(shí)現(xiàn)了芯片內(nèi)SERS檢測(cè)和生物芯片的再生。

圖7 (a)用于LDR反應(yīng)中目標(biāo)DNA的SERS微流控電動(dòng)驅(qū)動(dòng)微阱裝置。從下往上依次為修飾有電極的Pyrex玻璃襯底、微阱陣列(直徑10m、高度8m)及功能化的PDMS金電極。通過極性來(b)吸引目標(biāo)分子或(c)排斥非目標(biāo)分子[93]

Fig 7 (a) A SERS microfluidic platform with an electroactive microwell for single nucleotide polymorphisms detection in LDR. From the bottom to the top: Pyrex glass substrates modified with electrodes, microwell arrays (10m in diameter, 8m in height) and functionalized PDMS gold electrode.. (b-c)Selective attraction and rejection achieved by controlling the polarity[93]

作為疾病標(biāo)志物的微小RNA(miRNAs)的靈敏檢測(cè)可以促進(jìn)疾病的診斷和治療。許多用于miRNAs定量檢測(cè)的方法如基于PCR的方法或雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[96]，需要復(fù)雜和耗時(shí)的程序，Wang等[97]設(shè)計(jì)了一種可觸發(fā)式相互放大信號(hào)(TMAS)探針，在微流控芯片中用SERS對(duì)miRNA進(jìn)行一步定量檢測(cè)。相互放大信號(hào)的兩個(gè)TMAS探針是通過目標(biāo)miRNA啟動(dòng)的無酶靶鏈位移循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生的，從而產(chǎn)生增強(qiáng)的SERS信號(hào)(圖8)。另外采用交流電動(dòng)流動(dòng)技術(shù)的微流控芯片產(chǎn)生高效混合和快速富集，以提高DNA雜交率，進(jìn)一步提高SERS信號(hào)強(qiáng)度。該方法可在30 min內(nèi)快速、靈敏地檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞中miRNA-21的含量，檢測(cè)限為2.33 fM。與傳統(tǒng)方法相比，該方法克服了操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。Prado等[98]將SERS液滴微流控用于無標(biāo)記檢測(cè)寡核苷酸RNA。液滴微流控允許內(nèi)部流體再循環(huán)從而進(jìn)行快速有效的混合，防止納米粒子堵塞通道，該條件下RNA拉曼信號(hào)的極大值在液滴的中心，且在液滴形成并混合后的一段特定的時(shí)間后測(cè)得，這為提高SERS信號(hào)的重復(fù)性提供了有效的手段。該初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SERS液滴微流控?zé)o標(biāo)記檢測(cè)純寡核苷酸RNA的可行性，對(duì)于混合物光譜重疊問題，他們將應(yīng)用原先開發(fā)的SERS光譜分解程序估計(jì)混合物中每種堿基的百分比。

圖8 基于信號(hào)相互放大機(jī)制的SERS微流控平臺(tái)測(cè)量miRNA-21的裝置圖[97]

Fig 8 The schematic diagram describing the use of mutual-signal amplification mechanism-based SERS-microfluidics platform for miR-21 detection[97]

SERS微流控系統(tǒng)因具備以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)而常被用于蛋白質(zhì)檢測(cè)：首先SERS檢測(cè)是在與生理?xiàng)l件相似的水環(huán)境中進(jìn)行的，有助于維持蛋白質(zhì)的固有形態(tài)；SERS基底的高增強(qiáng)能力使激發(fā)激光功率盡可能低，測(cè)量時(shí)間盡可能短，大大減少了激光造成的損傷；微通道中的流動(dòng)流體不僅有效地避免了樣品在激光斑點(diǎn)處的局部加熱，而且保持了測(cè)量條件的穩(wěn)定性和一致性；貴金屬納米材料周圍的配體可以防止蛋白質(zhì)與銀之間的直接化學(xué)相互作用，并減少對(duì)蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的影響。Lu等[44]基于以上條件設(shè)計(jì)了一種特殊的微流控通道(圖2c)，混合效率高且增強(qiáng)了分析物落入SERS熱點(diǎn)的幾率，對(duì)外周髓鞘蛋白PMP22蛋白的野生型和突變體G150D的第四跨膜(TM4)螺旋構(gòu)象隨環(huán)境pH變化差異進(jìn)行了原位觀察和分析。Reza等[48]開發(fā)出一種用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物的SERS標(biāo)記微流控芯片，利用表面功能化的氧化石墨烯(GO)即修飾有納米酵母單鏈抗體(NY-scFv)來捕獲目標(biāo)蛋白。交流電動(dòng)力(AC-EHD)驅(qū)動(dòng)流體增強(qiáng)混合效率，從而提高NY-scFv與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，同時(shí)減少非特異性作用。Choi等[99]報(bào)道了一個(gè)完全集成化的SERS微液滴芯片，用于鼠疫菌F1抗原的自動(dòng)免疫分析。該系統(tǒng)包括液滴產(chǎn)生、傳輸、混合、合并和分裂模塊，實(shí)現(xiàn)了快速、高效的免疫反應(yīng)及無需洗滌的免疫分析。基于SERS的微滴平臺(tái)檢測(cè)鼠疫菌F1抗原的檢測(cè)限為59.6 pg mL-1，比常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)靈敏度高約2個(gè)數(shù)量級(jí)。為了實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)或其他生物分子的分離和捕獲，往往需要在芯片上集成復(fù)雜的通道或微器件等，Xiong等[28]報(bào)道了一種磁性納米鏈集成的微流控芯片，該磁性納米鏈不僅作為納米級(jí)攪拌棒加速溶液混合，還可用作特定生物分離的捕獲劑，磁性納米鏈的引入簡化了微芯片的平面設(shè)計(jì)(圖9a)，芯片僅由平坦的通道組成(圖9b)。磁性納米鏈上的抗體捕獲和分離目標(biāo)蛋白，再用SERS納米探針進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可同時(shí)用于檢測(cè)多種蛋白(圖9d)。另外芯片很容易被改進(jìn)成多通道陣列(圖9c)，用于多樣本的平行分析，大大改善了分析動(dòng)力學(xué)。該體系已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在8 min內(nèi)對(duì)1L體液中的癌蛋白和細(xì)菌進(jìn)行超靈敏的鑒定和定量。

圖9 (a)磁性納米鏈集成的SERS微流控芯片的設(shè)計(jì)圖；芯片實(shí)物圖: (b)單通道和(c)多通道陣列，微通道中填充了紅色染料(標(biāo)尺：0.5 cm)；(d)芯片用于檢測(cè)癌蛋白的原理圖[28]

Fig 9 (a)Schematic diagram of the magnetic nanochain integrated SERS microfluidic chip; photographs of the chip with (b) single channel and (c) multichannel arrays filled with a red dye(scale bar: 0.5?cm); (d) the mechanism for the detection of cancer proteins[28]

3.2 細(xì)胞分析

微流控SERS結(jié)合了微流控的微型高效自動(dòng)化和SERS的高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞分析領(lǐng)域有著許多重要的應(yīng)用，如細(xì)胞捕獲、分選、鑒定、定量分析、通信監(jiān)測(cè)以及藥物與細(xì)胞間相互作用檢測(cè)等。

為了穩(wěn)定地捕獲細(xì)胞并保持細(xì)胞的活性，我們課題組采用交流介電泳(AC-DEP)微流控芯片裝置，可以通過加電捕獲細(xì)胞(如圖10a所示)[45]。利用微流控SERS技術(shù)進(jìn)行活細(xì)胞檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了雙氫青蒿素(DHA)對(duì)HeLa細(xì)胞作用和效果的定量分析與評(píng)估。實(shí)驗(yàn)采用DHA調(diào)控細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)，通過在微流控芯片中測(cè)量細(xì)胞SERS信號(hào)，確定在不同劑量DHA下納米粒子分別進(jìn)入正常細(xì)胞(293T)和HeLa細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)測(cè)量了不同藥物劑量下細(xì)胞的存活率。另外，我們課題組還設(shè)計(jì)了一種具有微阱的微流控芯片[100](圖10b-d)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞的分離與捕獲，再進(jìn)行SERS檢測(cè)以得到進(jìn)入HeLa細(xì)胞內(nèi)的銀納米粒子數(shù)量，用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，從而得到細(xì)胞毒性與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的銀納米粒子數(shù)量的定量關(guān)系，同時(shí)也建立了一種基于微流控SERS技術(shù)分析銀納米顆粒對(duì)細(xì)胞毒性作用的方法。

圖10 (a)交流介電泳微流控SERS系統(tǒng)裝置圖[45]；(b)SERS微流控裝置用于單細(xì)胞分析的裝置圖；(c) 通道中細(xì)胞流動(dòng)及微阱捕獲的微觀圖；(d) 微阱捕獲單個(gè)細(xì)胞的過程[100]

Fig 10 (a)Schematic diagram of the microfluidic SERS platform based on AC-DEP for cell manipulation[45]; (b) the SERS microfluidic device for single-cell analysis; (c) microscopic image showing both the cells moving inside the microfluidic channel and the single cell trapped in the microfluidic well; (d) steps of trapping single cells in the micro-wells[100]

通過SERS微流控獲得細(xì)胞信號(hào)并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和鑒別，往往需要結(jié)合一種或多種化學(xué)計(jì)量法。Pallaoro等[101]將流動(dòng)聚焦微流控通道與拉曼光譜相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了一定程度上癌細(xì)胞與正常細(xì)胞比例的測(cè)定。他們合成了連有亞甲基藍(lán)或硫堇兩種拉曼活性分子的銀納米二聚體，用PVP包裹后進(jìn)行多肽修飾，作為兩種生物拉曼探針(SBT)。NRP-SBT探針可靶向前列腺癌細(xì)胞上過度表達(dá)的神經(jīng)氈蛋白-1(NRP)，而作為對(duì)照的PC-SBT即可與正常細(xì)胞又與癌細(xì)胞作用。通過用SBT標(biāo)記哺乳動(dòng)物細(xì)胞并使其在流動(dòng)聚焦的微流體通道中流動(dòng)，可以通過激光拉曼快速地逐一檢測(cè)細(xì)胞，經(jīng)過簡單的數(shù)據(jù)處理即可得到NRP/PC。在所得數(shù)據(jù)中偶爾會(huì)出現(xiàn)偏差較大的不可信的值，這可能是由于某個(gè)癌細(xì)胞的大部分都和NRP-SBT相連了。他們組在另一篇文章[102]中基于同樣的方法，且結(jié)合了主成分分析和最小二乘法，用著兩種分析方法對(duì)所得大量的SERS信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，提高了檢測(cè)方法的可信度和可重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)了在低濃度下對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的區(qū)分鑒別。Zhang Y等[103]將基于尺寸差分離細(xì)胞的微流控芯片與SERS光譜相結(jié)合，采得的多維譜圖再根據(jù)數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行簡化，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜蛋白的原位分析以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)亞群的鑒定(圖11)。在微流控芯片中，基于CTC和血細(xì)胞之間的大小差異，微流體過濾器將CTC從血液中分離出來。而采用的SERS探針是連接有不同的DNA適配體的Au@Ag納米顆粒，以同時(shí)靶向細(xì)胞膜上不同的蛋白。為了簡化復(fù)雜的SERS指紋譜，采用修正的經(jīng)典最小二乘法以獲得單個(gè)細(xì)胞的表型信息。最后，使用偏最小二乘法判別分析來精確分類不同亞型的細(xì)胞?；谖⒘骺豐ERS系統(tǒng)，Cho等[104]為了實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的鑒定，采用了五種拉曼活性分子對(duì)五種表面標(biāo)記物進(jìn)行編碼，增加了譜圖的維度和難度。對(duì)循環(huán)腫瘤干細(xì)胞(CCSC，一種稀有的CTC亞型細(xì)胞)和其他三種不同的CTC細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。Xu等[105]提出了一種將無標(biāo)記SERS技術(shù)與軟管狀微流控技術(shù)相結(jié)合的動(dòng)態(tài)SERS微流控檢測(cè)細(xì)胞的平臺(tái)。微流控芯片是由一個(gè)商業(yè)微軟管嵌入到3D打印的模板中形成的，以一小段石英毛細(xì)管作為SERS檢測(cè)區(qū)，銀納米星作為無標(biāo)記的SERS基底。在樣品流動(dòng)狀態(tài)下，對(duì)1株正常乳腺細(xì)胞系和2株乳腺癌細(xì)胞系的SERS光譜進(jìn)行連續(xù)采集，最后采用K-最近鄰(K-NN)算法對(duì)三種類型的細(xì)胞進(jìn)行精確分類。

圖11 基于尺寸差分離細(xì)胞的SERS微流控芯片用于CTCs的捕獲、細(xì)胞表型分析和分類的流程圖[103]

Fig 11 The flow diagram of operating on the platform for CTCs capture, profiling of cell phenotype, and classification based on the integrated system of size-based microfluidic cell isolation and multiple spectrally orthogonal SERS analysis[103]

微流控SERS分析細(xì)胞表達(dá)上具有重要應(yīng)用，Dey等[106]提出了一種微流控SERS平臺(tái)用于抗原特異性T細(xì)胞的分離和免疫表型分析。他們基于T細(xì)胞受體(TCR)和肽主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)相互作用從復(fù)雜生物樣品中分離抗原特異性T細(xì)胞，使用交流電EHD增強(qiáng)pMHC和TCR相互作用的頻率，降低非特異性作用，再使用單點(diǎn)直流脈沖釋放T細(xì)胞以便后續(xù)的檢測(cè)。用SERS標(biāo)記的pMHCs編碼T細(xì)胞，以分析T細(xì)胞TCR表達(dá)的異質(zhì)性，可以反映T細(xì)胞的活化狀態(tài)或患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)。這種方法在監(jiān)測(cè)免疫狀態(tài)、理解治療應(yīng)答和有效的疫苗開發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用潛力。Willner等[107]使用微流控裝置將單個(gè)前列腺癌細(xì)胞和小麥胚芽凝集素功能化的SERS納米探針包裹在油包水液滴中，隨后將其鎖定在儲(chǔ)存液滴的陣列中，用于光譜檢測(cè)。通過快速檢測(cè)獲得粗糙譜圖，隨后針對(duì)有價(jià)值的癌細(xì)胞熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行分析，以研究細(xì)胞間和胞內(nèi)變異對(duì)細(xì)胞膜上聚糖表達(dá)的影響。

SERS微流控還被應(yīng)用于細(xì)胞分泌物的檢測(cè)，Sun等[108]提出將SERS微液滴芯片用于同時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞分泌的兩種細(xì)胞因子。他們利用抗原抗體特異性識(shí)別捕獲目標(biāo)物，免疫夾心法使Ag NPs靠近磁性納米顆粒上的拉曼染料，觸發(fā)SERS信號(hào)。磁場(chǎng)作用誘導(dǎo)了Ag NPs的自發(fā)聚集，增強(qiáng)SERS信號(hào)。除此之外，單個(gè)液滴包裹的細(xì)胞因子隨著時(shí)間的推移積聚起來，進(jìn)一步增強(qiáng)SERS信號(hào)。在單個(gè)液滴中檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)，檢出限低至1.0 fg mL-1。另外，他們應(yīng)用這種超靈敏的SERS微液滴芯片對(duì)單個(gè)液滴中多個(gè)細(xì)胞分泌的VEGF和IL-8進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用可能通過VEGF和IL-8的上調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞血管的生成。

3.3 疾病診斷

進(jìn)一步，利用微流控SERS技術(shù)檢測(cè)與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，可顯著提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性，減少了樣品體積，降低檢測(cè)時(shí)間，簡化診斷過程，為疾病的早期診斷提供了新的方法。例如，Su等[109]設(shè)計(jì)并制作了一種集血液分離和原位檢測(cè)為一體的SERS微流控芯片，用于臨床血樣血肌酐的快速檢測(cè)。該SERS微流控芯片所需血樣量少、可重復(fù)使用、操作方便且可回收利用，同時(shí)，在芯片上集成了多個(gè)微流控SERS單元，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一血液樣本的平行檢測(cè)或?qū)Σ煌簶颖镜亩嗦窓z測(cè)，為臨床腎病的快速診斷提供一種新的方法。Cheng等[27]設(shè)計(jì)了一種電驅(qū)動(dòng)SERS微流控平臺(tái)(圖12)，用于長距離濃縮人血中的稀有病原體并進(jìn)行快速檢測(cè)。利用交流電場(chǎng)誘導(dǎo)介電泳和電流體力學(xué)的混合電動(dòng)機(jī)制，使細(xì)菌可以集中在SERS活性粗糙電極上的停滯區(qū)，而血細(xì)胞則被排除在同心圓電極中心區(qū)域之外。該方法在3分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的分離和濃縮，密度因子增加了約1000倍。此外，在分離的細(xì)菌血癥感染中發(fā)現(xiàn)的三種細(xì)菌，分別是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌，在不到一分鐘的時(shí)間內(nèi)就被成功地鑒定出來，無需任何抗體或化學(xué)固定和反應(yīng)過程。該方法的檢出限為50L樣品中的數(shù)百個(gè)細(xì)菌，約為103CFU mL-1。Lu等[110]制作的微液滴芯片可在3.5 h內(nèi)采集58株金黃色葡萄球菌的17400 個(gè)SERS譜圖，具備快速、高通量檢測(cè)性能，并且基于SERS的偏最小二乘回歸模型準(zhǔn)確地測(cè)定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在含有甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的混合物中的濃度。該研究體現(xiàn)了SERS微流控系統(tǒng)在細(xì)菌感染檢測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

圖12 (a)實(shí)驗(yàn)裝置圖：SEM圖像顯示了中心電極表面粗糙的Au，采用交流電場(chǎng)誘導(dǎo)介電泳和電流體力學(xué)方法快速濃縮人血中的細(xì)菌，通過濃縮后細(xì)菌的SERS指紋圖譜鑒定細(xì)菌；(b)在大范圍不對(duì)稱電極陣列上選擇性濃縮目標(biāo)細(xì)菌的原理圖[27]

Fig 12 (a) Experimental setup of electrokinetic SERS microfluidic chip: the SEM image showing the roughened Au surface on the central electrode, AC electric field induced dielectrophoresis and electrohydrodynamics for rapid bacteria concentration from human blood, and SERS Raman spectroscopy of the concentrated bacteria for bacteria identification; (b) the mechanism of selective bacteria concentration over a wide range asymmetric electrode array[27]

SERS微流控芯片有望成為人體體液中生物標(biāo)志物檢測(cè)的有力工具，對(duì)臨床診斷和人體健康評(píng)價(jià)具有指導(dǎo)意義。Wu等[111]采用SERS微液滴芯片對(duì)人血清和唾液中硫氰酸鹽(SCN-)進(jìn)行了定量分析，SCN-是人體健康評(píng)價(jià)系統(tǒng)中的重要生物標(biāo)志物之一。他們選用具有較大SERS增強(qiáng)因子的金銀核殼納米棒(Au@Ag NRs)捕獲體液中的SCN-，根據(jù)-C≡N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的2100 cm-1拉曼峰強(qiáng)度進(jìn)行定量。整個(gè)檢測(cè)過程只需幾分鐘，實(shí)際樣本只需幾微升，人血清中SCN-的檢測(cè)限為1M。此外，還可快速檢測(cè)人唾液中的SCN-，該結(jié)果與是否吸煙以及煙齡相關(guān)。當(dāng)檢測(cè)的標(biāo)志物為蛋白質(zhì)一類如癌胚抗原，可采用抗體修飾的SERS基底捕獲目標(biāo)物，Li等[81]在此基礎(chǔ)上又引入了抗體修飾的磁性納米材料(圖3d)，通過磁場(chǎng)對(duì)捕獲的目標(biāo)物進(jìn)行聚焦，進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)，癌胚抗原的檢測(cè)限低至0.1 pM。癌癥標(biāo)志物的快速、有效檢測(cè)有利于早期癌癥篩查，而同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志物對(duì)于提高癌癥診斷的準(zhǔn)確性具有重要意義。Gao等[112]設(shè)計(jì)了一種全自動(dòng)SERS液滴微流控平臺(tái)，用于同時(shí)檢測(cè)兩種前列腺癌標(biāo)志物。以他們團(tuán)隊(duì)之前設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)鼠疫菌F1抗原的微液滴芯片為基礎(chǔ)，增加了一個(gè)并行微流控通道，是為了在同一塊芯片上同時(shí)進(jìn)行兩路檢測(cè)。結(jié)果表明，在0.05 ～ 100 ng mL-1的范圍內(nèi)，兩種PSA標(biāo)志物均有良好的線性響應(yīng)，檢出限均在0.1 ng mL-1以下。Gao等[113]近期還報(bào)道了一個(gè)無泵SERS液滴微流控平臺(tái)用于檢測(cè)人血清中PSA標(biāo)志物，通過芯片底部的毛細(xì)通道驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)，檢測(cè)可在5 min內(nèi)完成，無需人工孵育和沉重的注射器泵。結(jié)果表明，該芯片在0.01 ～ 100 ng mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，檢出限在0.01 ng mL-1以下。

3.4 藥物檢測(cè)和篩選

SERS微流控芯片也為藥物檢測(cè)和篩選提供了一種快速、靈敏且高通量檢測(cè)分析的手段。SERS微流控芯片可用于治療藥物監(jiān)測(cè)，即分析治療性藥物在體液中的濃度以指導(dǎo)臨床藥物治療的方法。血液中的游離藥物是進(jìn)行藥物作用的有效部分，更容易與受體結(jié)合或被代謝。Zhang等[114]采用SERS微液滴芯片方法檢測(cè)人血清中的一種抗癌藥物6-硫鳥嘌呤，該裝置在提高測(cè)定重復(fù)性方面具有優(yōu)勢(shì)，變異系數(shù)不超過5%(n=25)，檢測(cè)速度快，每次檢測(cè)僅需10s。Wu等[33]設(shè)計(jì)的多功能微流控芯片可監(jiān)測(cè)Hela細(xì)胞分泌物的動(dòng)態(tài)變化以及Hela細(xì)胞對(duì)藥物的免疫響應(yīng)，從而用于藥物篩選。SERS微流控芯片也被嘗試用于體液中興奮劑的檢測(cè)，Gjergjizi等[115]設(shè)計(jì)了一種被動(dòng)閥的微流控芯片，結(jié)合SERS以檢測(cè)人血清中的黃體生成素(LH)，極大地改善了傳統(tǒng)LH檢測(cè)方法耗時(shí)長、基質(zhì)效應(yīng)干擾等問題，不需要預(yù)制備、預(yù)富集和免疫催化反應(yīng)等步驟?？贵w修飾磁性金納米粒子捕獲LH，與4-氨基噻吩(4-ATP)標(biāo)記的金納米顆粒形成夾心免疫結(jié)構(gòu)，通過記錄4-ATP的SERS信號(hào)，可以探測(cè)血清中微量LH。Salemmilani等[78]報(bào)道了一種基于微流控介電泳誘導(dǎo)的SERS裝置，它能在2分鐘內(nèi)檢測(cè)唾液中冰毒的生理濃度，用主成分分析法(PCA)區(qū)分冰毒陽性樣品和陰性對(duì)照樣品。對(duì)唾液等體液中非法藥物的快速檢測(cè)，其在醫(yī)療保健和執(zhí)法方面具有很大的實(shí)用價(jià)值。Kong等[55]采用由多孔光子晶體生物二氧化硅作為微流體通道的材料，構(gòu)建了硅藻土微流控分析裝置。該芯片可用作色譜，從復(fù)雜的生物流體樣品中分離小分子，并對(duì)獲得的目標(biāo)化學(xué)品進(jìn)行SERS檢測(cè)。在與拉曼染料分子的混合樣品中芘的檢測(cè)限達(dá)到1 ppb，且該系統(tǒng)檢測(cè)人血漿中的可卡因的檢測(cè)限達(dá)到10 ppb。

3.5 環(huán)境健康與食品衛(wèi)生

此外，與人類健康相關(guān)，環(huán)境和食品中的污染物如重金屬、非法添加劑、濫用藥物及細(xì)菌病毒等對(duì)人類的健康和社會(huì)秩序帶來了嚴(yán)重威脅，SERS微流控系統(tǒng)也可用于檢測(cè)環(huán)境和食品痕量污染物，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。近年來，人們也把SERS與微流控相結(jié)合應(yīng)用于環(huán)境和食品檢測(cè)方面[24]。例如，Wilson等[116]設(shè)計(jì)了具有被動(dòng)混合階段的微流體管道，在微流體反應(yīng)器中原位合成膠體銀，隨后在管道中和分析物充分混合，進(jìn)而檢測(cè)待測(cè)物。他們將該裝置用于檢測(cè)偽枝藻素(藍(lán)藻細(xì)菌的一種天然色素)，檢測(cè)限約10 pM。Bai等[117]在3D玻璃微流體通道中構(gòu)建2D Cu-Au金屬納米點(diǎn)陣，實(shí)現(xiàn)超高靈敏度的SERS檢測(cè)，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)水樣中濃度低至10 ppb的Cd2+。Wang[118]利用SERS分子探針通過一步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)菌的檢測(cè)，采用兩種SERS分子免疫探針同時(shí)識(shí)別病原體不同的表位。為了降低方法的檢測(cè)限并實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，他們?cè)O(shè)計(jì)了一種納米DEP微流體裝置，用來富集水樣中低濃度病原體，使得該方法的檢測(cè)限達(dá)到了100CFU mL-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DEP常用細(xì)菌濃度(>106CFU mL-1)，因此可用于檢測(cè)飲用水中的病原體。Galarreta等[119]在玻璃蓋玻片表面通過電子束光刻金屬納米結(jié)構(gòu)，并將其嵌入PDMS的微流體通道中，作為SERS平臺(tái)，并用該系統(tǒng)對(duì)赭曲霉素A進(jìn)行了定性檢測(cè)。Kim等[120]在微流控芯片內(nèi)通過納米壓印光刻法構(gòu)建納米柱陣列，將其作為SERS基底，結(jié)合便攜式拉曼光譜儀可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺。Dou等[121]用裸露的金納米顆粒負(fù)載于微流控紙芯片上，選擇性地增強(qiáng)豬毛發(fā)提取物中的β-受體激動(dòng)劑的SERS信號(hào)，檢測(cè)限可達(dá)ng mL-1級(jí)別。整個(gè)裝置材料十分簡易且便宜，也無需化學(xué)標(biāo)記、純化和分離，操作簡單，有利于現(xiàn)場(chǎng)的及時(shí)檢測(cè)和分析。Gao等[122]在微液滴芯片上實(shí)時(shí)生長銀納米顆粒，同時(shí)與另一個(gè)含有敵草快二溴化物(DQ)的液滴相混合，再進(jìn)行SERS檢測(cè)。使用這種可生成間斷且流動(dòng)的液滴的裝置，其目的是避免因銀納米顆粒聚集在管壁上造成的記憶效應(yīng),該系統(tǒng)對(duì)水樣中DQ的檢測(cè)限達(dá)到了5 nM。

4 總結(jié)與展望

近年來，SERS與微流控技術(shù)相結(jié)合在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生、食品健康等領(lǐng)域得到了大量的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用和深入研究。但是，為了實(shí)現(xiàn)SERS微流控系統(tǒng)實(shí)用化和商業(yè)化的目標(biāo)，微流控SERS技術(shù)還需要克服一些困難。目前，多數(shù)微流控SERS仍存在信號(hào)重復(fù)性低和被分析物污染的問題。盡管對(duì)微流控通道中連續(xù)流過的樣品進(jìn)行快速檢測(cè)和平均化可提高SERS信號(hào)的重現(xiàn)性，但是金屬膠體的布朗運(yùn)動(dòng)可引起的樣品的隨機(jī)聚集，仍然會(huì)引起SERS信號(hào)的不穩(wěn)定。另外為了使金屬膠體和分析物充分混合，需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的微通道，這又可能會(huì)交叉污染和通道堵塞，也會(huì)帶來記憶效應(yīng)。這些缺陷阻礙了SERS微流控系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用。當(dāng)前，研究者分別從微流控芯片和SERS兩部分的設(shè)計(jì)上入手，尋找解決以上問題的方案。首先，要獲得可靠的且重復(fù)性好的SERS信號(hào)，其關(guān)鍵還在于提高SERS活性基底的質(zhì)量。另一方面，微流控系統(tǒng)可通過對(duì)膠體的可逆操控實(shí)現(xiàn)其在微流控通道中的可控聚集，從而提高SERS信號(hào)的的重現(xiàn)性。其次，關(guān)于芯片易被污染堵塞等問題，隨著芯片制作材料、制作技術(shù)及加工手段等的進(jìn)步，可以設(shè)計(jì)出成本極低的紙基芯片作為一次性芯片使用，或在通道中固定固體金屬納米陣列材料，從而避免因混合造成的交叉污染和通道堵塞，以及利用非連續(xù)流微液滴芯片來降低通道中的記憶效應(yīng)。除此以外，為了提高SERS微流控芯片的檢測(cè)性能如檢測(cè)通量、靈敏度等，還可以設(shè)計(jì)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品的微陣列芯片，以提高芯片的分析效率和通量。另外，利用SERS芯片的流體操控可以增強(qiáng)對(duì)分析樣品的操縱和捕獲能力，或應(yīng)繼續(xù)研發(fā)新型的SERS活性基底以提高樣品的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于復(fù)雜樣品，目標(biāo)分析物與其它混合物的拉曼光譜可能有嚴(yán)重重疊，這時(shí)就需對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離、富集等預(yù)處理，也可以通過改進(jìn)芯片結(jié)構(gòu)或功能來實(shí)現(xiàn)，例如，可通過各種微器件如微泵、微閥、微通道等相互配合達(dá)到樣品預(yù)處理的功能。最后，對(duì)于多樣品多參數(shù)問題、數(shù)據(jù)量大的情況，后期需要采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法、結(jié)合大數(shù)據(jù)和智能計(jì)算等方式，以此對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確分析。總之，我們相信，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展，SERS與微流控技術(shù)兩者可以更好地結(jié)合在一起，將在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。