胡久略，商 健，侯紫君，臧文華，卞 華，王 軍，

王三沆1,2，樊 赟1,2，張瓅方1,2

(1.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室，南陽 473004；2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，南陽 473004；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由于腦血管系統(tǒng)的病理改變導(dǎo)致的缺血性、缺氧缺血或者出血性腦損傷所引起的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。VD是繼阿爾茨海默氏病之后世界上第二常見的老年癡呆癥，約占所有癡呆疾病的15%～20%[1]。認(rèn)知功能障礙被廣泛認(rèn)為是癡呆患者表現(xiàn)的典型特征[2]，包括認(rèn)知功能和運動功能缺失，功能域和記憶障礙。目前臨床直接用于VD治療的藥物較少，且相關(guān)的藥效學(xué)研究不系統(tǒng)。溫腎醒腦方在臨床上廣泛用于治療VD，實驗觀察溫腎醒腦方對雙側(cè)頸動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠VD的改善作用及其抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制。

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗藥物制備

(1)實驗藥物：溫腎醒腦方中附子、巴戟、桂枝、半夏、石菖蒲、赤芍、淫羊藿、生曬參、大黃、遠(yuǎn)志、甘草均一次性購于河南省藥材公司，并經(jīng)南陽理工學(xué)院中藥教研室鑒定。

(2)制備：全方(附子20 g、巴戟15 g、桂枝12 g、半夏10 g、石菖蒲12 g、赤芍15 g、淫羊藿10 g、生曬參10 g、大黃6 g、遠(yuǎn)志10 g、甘草6 g。加水回流提取兩次,第一次加10倍水提取2 h,第二次加8倍水提取1.5 h,藥液過濾、合并濃縮至含生藥1 g/mL,4 ℃保存?zhèn)溆?用時稀釋適當(dāng)濃度。

1.2 藥物和試劑

溫腎醒腦方藥材購于張仲景大藥房，經(jīng)南陽理工學(xué)院中藥教研室鑒定為道地藥材。腦復(fù)康片：0.4 g/片(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H13021787)，購自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、一氧化氮合成酶(NOS)試劑盒，均購買自南京建成生物工程研究所。H &E染色試劑盒，購自北京雷根生物科技有限公司。Trizol Reagent購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒、引物設(shè)計及RT-PCR試劑耗材，均購自Takara公司。組織蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑和LightShift Chemiluminescent EMSA試劑盒均購自ThermFisher Scientific公司。核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)、醌NADH脫氫酶(NQO1)、血紅素氧合酶1(HO-1)、GAPDH抗體均購自Abcam公司。山羊抗兔的二抗、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒，購于碧云天生物有限公司。ECL發(fā)光液購自Merck Millipore公司，0.45 μm PVDF膜購自美國伯樂公司。牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

健康成年Wistar大鼠70只，雄性，清潔級，體重200～250 g，由河南省實驗動物中心提供。動物許可證號：醫(yī)動字第20-012號。

1.4 主要儀器

Morris水迷宮及實驗視頻分析系統(tǒng)，上海吉量軟件科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀，瑞典Tecan公司；StepOnePlus熒光實時定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；蛋白電泳凝膠儀，美國Biotech生物有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；Leica TP1020生物組織自動脫水機(jī)、Leica EG1140石蠟包埋機(jī)、Leica RM2235全自動輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)，均是德國萊卡公司；高速低溫離心機(jī)，日本Hitachi公司。

2 實驗方法

2.1 分組、模型建立和給藥

根據(jù)“勞倦過度、房室不節(jié)”[3]和高脂飲食制作腎虛痰瘀模型[4-5]：每天在水深25 cm，水溫25 ℃，容積5 L的圓型玻璃缸內(nèi)強(qiáng)迫大鼠游泳至無力而下沉?xí)r撈出以誘導(dǎo)勞倦過度；每只雄鼠與6只動情期雌鼠同籠，每天更換動情期雌鼠以誘導(dǎo)房室不節(jié)，共30 d。同時喂飼高脂飼料(高脂飼料組成：81.3%普通飼料、0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、0.2%丙基巰氧嘧啶、10%豬油、5%白糖)20 g，火腿腸14 g，連用30 d。腎虛痰瘀模型建立成功后，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰臥固定在手術(shù)臺上，消毒后，頸正中切口，縱向切開皮膚及皮下組織，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，手術(shù)中注意避免刺激迷走神經(jīng)。隨后用無菌手術(shù)線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，觀察大鼠生命體征正常，再縫合傷口，放回籠飼養(yǎng)。其中假手術(shù)組僅分離頸總動脈后不結(jié)扎縫合傷口，放回籠飼養(yǎng)。大鼠造模清醒后給與自由飲水。

腎虛痰瘀VD模型建立成功按照隨機(jī)分組，每組10只：正常組、假手術(shù)組、模型組、腦復(fù)康組(0.15 g/kg)、溫腎醒腦方給藥組(高劑量組5 g/kg、中劑量組2.5 g/kg、低劑量組1.25 g/kg)。其中正常組、假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃2 mL/d，灌胃給藥4周。

2.2 行為學(xué)實驗

灌胃給藥結(jié)束后，采用Morris水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。檢測指標(biāo)包括定位航行實驗：記錄大鼠下水至站到隱藏平臺的時間(逃避潛伏期)，如果2 min還未找平臺，實驗者將其引導(dǎo)至平臺上停留15 s，逃避潛伏期記為2 min，連續(xù)進(jìn)行5 d實驗；定位航行能力實驗檢測結(jié)束后，次日進(jìn)行空間探索實驗，檢測大鼠2 min內(nèi)在隱藏平臺所在象限的游泳總距離和跨越平臺的次數(shù)。

2.3 樣本收集

在空間探索實驗結(jié)束后，將大鼠麻醉后，腹主動脈取血，室溫放置2 h后，3 000 r/min離心10 min，取處上清液保存-80 ℃；用生理鹽水灌注心臟后直至肝臟顏色變成白色后，用剪刀快速斷頭，迅速剝離完整腦組織。部分放入10%中性甲醛，部分迅速放入液氮過夜，第2 d放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 腦組織生化指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書對SOD、MDA、GSH-Px、NOS指標(biāo)進(jìn)行檢測，運用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

2.5 病理切片觀察

腦組織用10%中性甲醛溶液浸泡固定48 h，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片(5 μm)，H &E染色后，中性樹脂封片。在光鏡下觀察組織病理變化并拍照。

2.6 RT-PCR檢測mRNA

根據(jù)GenBank提供序列號設(shè)計與合成特異性引物:NQO1(NM_012580.2)、HO-1(NM_01258.2)、GAPDH(NM_017008.4)序列如表1所示。各組大鼠腦組織100 mg加入Trizol試劑，按照說明書進(jìn)行總mRNA提取分離純化。按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)體系：2×TB Green premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線和溶解曲線，溶解曲線程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，記錄各組樣本擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，運用公式2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 大鼠引物相關(guān)信息Table 1 Primer related information of rats

2.7 Western Blot檢測

取各組大鼠腦組織100 mg加入蛋白裂解液進(jìn)行勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。取上清液，取10 μL稀釋用于BCA法蛋白定量。剩余的加入Loading buffer進(jìn)行蛋白變性。取50 μg蛋白樣本上樣進(jìn)行電泳分離，然后加入濾紙、PVDF膜和海綿，300 mA轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜完后加入BSA封閉液，搖床上室溫封閉2 h。按照一抗說明書稀釋一抗，加入一抗，搖床上4 ℃孵育過夜。回收一抗后，加洗滌液3次，每次10 min。按照二抗說明書稀釋二抗，加入二抗，搖床上室溫封閉1 h?；厥斩购螅尤?次，每次10 min。使用ECL發(fā)光液試劑進(jìn)行蛋白檢測。

2.8 凝膠電泳遷移(EMSA)實驗

取100 mg腦組織采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，取適量用于BCA法蛋白定量。對寡核苷酸單鏈進(jìn)行生物素標(biāo)記，經(jīng)純化、變性、退火等操作后可獲取的雙鏈生物素標(biāo)記探針。按照EMSA試劑盒說明書進(jìn)行實驗，凝膠電泳遷移結(jié)合反應(yīng)體系中10 μg核蛋白中含10×Binding buffer 2μL、poly(dI·dC) 1 μL、NP-40(1%)1 μL、EDTA(200 mmol/L) 0.2 μL、MgCl2(100 mmol/L) 1 μL，Glycerol(50%) 1 μL,生物素標(biāo)記的雙鏈探針 20 fmol，超純水補足至20 μL。6%PAGE膠中進(jìn)行電泳分離后，凝膠中的樣本濕法電轉(zhuǎn)至尼龍膜上，轉(zhuǎn)移后將膜在120 mJ/cm2紫外交聯(lián)60 s。封閉，抗體孵育，洗滌，加底物平衡，洗滌。加入ECL后在成像儀上顯影。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 溫腎醒腦方對認(rèn)知能力改善情況

如表2所示，定位航行實驗中前2 d各組大鼠潛伏期沒有明顯差異。第3 d開始，VD模型組較正常組潛伏時間更長。第4 d與VD模型組比較，腦復(fù)康組和溫腎醒腦方高劑量組潛伏時間較短有顯著差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。第5 d各給藥組與VD組潛伏時間都有顯著差異(P<0.01)。如表3所示，空間搜索實驗中，與正常組比較，VD模型組游泳的總距離和穿越平臺次數(shù)較少，有統(tǒng)計學(xué)意義；與VD模型組比較，溫腎醒腦方高劑量組和腦復(fù)康組穿越平臺次數(shù)和游泳的總距離都有顯著差異(P<0.01)。

表2 各組定位航行實驗潛伏時間比較Table 2 Comparison of latency time of positioning navigation experiments in each group

注：*P<0.05、**P<0.01，vs正常組；#P<0.05，##P<0.01，vs模型組。

表3 各組空間搜索實驗?zāi)繕?biāo)象限游泳總距離及穿過站臺總數(shù)比較Table 3 Comparisons of total swimming distance and total number of crossing platform in each group of space search experiment target quadrant

注：*P<0.05，**P<0.01，vs正常組；#P<0.05，##P<0.01，vs模型組。

3.2 溫腎醒腦方對腦組織生化指標(biāo)的影響

如圖1所示，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px和NOS的含量明顯降低，同時MDA的含量顯著增加；與VD模型組，腦復(fù)康組和溫腎醒腦方各給藥組的SOD、GSH-Px和NOS的含量有一定程度的升高，同時MDA的含量顯著降低，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

3.3 溫腎醒腦方對腦組織中NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)影響

如圖2所示，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織NQO1和HO-1mRNA的表達(dá)量顯著減少(P<0.01)；與VD模型組比較，腦復(fù)康組和溫腎醒腦方各給藥組的NQO1和HO-1mRNA的表達(dá)量有不同程度上的升高，且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。

3.4 溫腎醒腦方對腦組織Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織細(xì)胞核中Nrf2的蛋白表達(dá)量顯著降低；與VD模型組比較，腦復(fù)康組和溫腎醒腦方各給藥組的明顯升高。然而，大鼠腦組織細(xì)胞質(zhì)中Keap1的蛋白表達(dá)量相反，與正常組比較，VD模型組大鼠腦組織細(xì)胞質(zhì)中Keap1的蛋白表達(dá)量較高；與VD模型組比較，腦復(fù)康組和溫腎醒腦方各給藥組的明顯降低。同時，腦復(fù)康組和溫腎醒腦方高劑量組大鼠腦組織中NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)量較高，與VD模型組比較。

*P<0.05，**P<0.01，vs 正常組；#P<0.05，##P<0.01，vs模型組圖2 溫腎醒腦方對腦組織中NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)影響Fig.2 Effect of Wenshen Xingnao decoction on the expression of NQO 1 and HO-1 mRNA in brain tissue

+、-分別表示組織蛋白表達(dá)(活性)的高和低；sham為假手術(shù)圖3 溫腎醒腦方對腦組織Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Wenshen Xingnao decoction on the protein expression of Nrf2,Keap1,NQO1 and HO-1 in brain tissue

3.5 溫腎醒腦方對腦細(xì)胞核中Nrf2-ARE結(jié)合活性的影響

如圖4所示，在正常組和假手術(shù)組腦組織中，Nrf2-ARE的結(jié)合活性存在，然而模型組中這種結(jié)合活性不明顯了。在給予溫腎醒腦方藥和腦復(fù)康后，結(jié)合活性增加，特別是腦復(fù)康和溫腎醒腦方高劑量給藥組最為顯著。

圖4 溫腎醒腦方對腦細(xì)胞核中Nrf2-ARE結(jié)合活性的影響Fig.4 Effect of Wenshen Xingnao decoction on Nrf2-ARE binding activity in brain nucleus

4 討論

VD作為一種的由于腦血管疾病導(dǎo)致腦組織損傷，認(rèn)知功能障礙為主病理特征的臨床綜合征，至少20%的癡呆是由它引起的，僅次于阿爾茨海默病[6]。表現(xiàn)為視空間功能障礙、記憶力和學(xué)習(xí)能力下降，運動障礙等等[7]。雙側(cè)頸總血管結(jié)扎后大鼠的定位航行能力和空間搜索能力下降明顯符合VD癥狀，但是溫腎醒腦方干預(yù)后能夠改善提高這些能力，一定程度上改善了VD的認(rèn)知障礙。

目前VD的發(fā)病機(jī)制研究主要與氧自由基、膽堿能系統(tǒng)、氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等相關(guān)。其中氧自由基產(chǎn)生是心腦系統(tǒng)缺血性致腦損傷的核心環(huán)節(jié)之一[8-9]。動物腦缺血會使得腦組織產(chǎn)生大量的自由基和過氧化產(chǎn)物，如MDA、過氧化脂質(zhì)(LPO)，同時清除自由基和過氧化物的相關(guān)酶SOD和GSH-Px明顯降低。然而，給予腦復(fù)康和溫腎醒腦方后，腦組織抗氧化指標(biāo)和腦組織病理情況的改善說明，溫腎醒腦方一定程度上能夠提高大鼠機(jī)體清除腦組織自由基的能力，改善腦組織損傷。

Nrf2是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，具有維持體內(nèi)氧化和抗氧化平衡，抑制炎癥和細(xì)胞凋亡等作用[10]。Nrf2基因敲除小鼠對應(yīng)激源的敏感性降低，氧化應(yīng)激損傷明顯增加[11]。生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1耦聯(lián)穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中。Nrf2-Keap1信號通路是機(jī)體抗氧化的重要途徑之一，外來刺激引起Nrf2與Keap1發(fā)生解離，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與ARE的特異識別位點相互結(jié)合，啟動ARE增加下游抗氧化酶如(NQO1、HO-1)的表達(dá)和GSH的合成，增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激刺激的抗性。對Nrf2-ARE信號的激活且可以反向抑制Nrf2蛋白的降解，增加Nrf2蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步保護(hù)下游基因的表達(dá)[12]。然而，雙側(cè)結(jié)扎頸總動脈VD大鼠，Nrf2的表達(dá)較少，降低了下游NQO1和HO-1的表達(dá)，使得腦組織損傷的產(chǎn)生。溫腎醒腦方可能通過增加Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性，啟動ARE調(diào)控的NQO1、HO-1的表達(dá)。NQO1表達(dá)量的增多，可以維持內(nèi)源抗氧化物的還原性；HO-1表達(dá)量增加能夠產(chǎn)生更多血紅素，而血紅素有很強(qiáng)的抗氧化性。在這些酶的作用下，氧化應(yīng)激被抑制，多余的ROS得到清除，最終實現(xiàn)體內(nèi)氧化還原平衡，達(dá)到改善VD認(rèn)知障礙的作用。

5 結(jié)論

根據(jù)內(nèi)經(jīng)“陽化氣，陰成形”的理論，認(rèn)為VD發(fā)生的病機(jī)多為腎(陽)虛痰瘀而致，基于此，創(chuàng)制了溫腎醒腦方。溫腎醒腦方由經(jīng)典名方四逆湯和地黃飲子化裁而來，具有溫腎助陽、祛瘀化痰、醒腦開竅之功。研究表明，溫腎醒腦方能夠通過Nrf2-ARE信號通路，升高SOD和GSH-Px，降低MDA、LPO，清除過多氧自由基，維持體內(nèi)氧化還原平衡，改善雙側(cè)結(jié)扎頸總動脈VD大鼠的認(rèn)知障礙。為“陽化氣，陰成形”理論在VD中的運用提供了科學(xué)依據(jù)。