夏姣云,徐 彤,卿 靜,熊 艷,劉俊杰,龔福春

(1.長沙理工大學化學與食品工程學院,長沙 410114; 2.國家城市供水水質監(jiān)測網(wǎng)長沙監(jiān)測站,長沙 410009)

鉛是一種具有累積性的有毒元素,是食品和工業(yè)重金屬污染最嚴重的問題之一[1].重金屬鉛中毒具有持續(xù)性和高度累積性,可不同程度地損害人體的泌尿系統(tǒng)、 生殖系統(tǒng)、 呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)內分泌系統(tǒng),嚴重危害人體健康[2,3].加強對Pb2+的監(jiān)測和控制非常必要,也十分重要.迄今,已有大量關于Pb2+的檢測方法,如比色法[4]、 光譜法[5,6]和電化學法[7～12]等.但這些方法存在檢測耗時長、 專業(yè)要求高、 需要大型儀器設備及高素質測試人員等缺點[13].因此,亟需開發(fā)檢測快速、 操作簡便且成本低廉的核酸適體生物傳感器用于檢測鉛離子[14～18].核酸適體是一種通過指數(shù)富集(SELEX)技術從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出的與靶物質高度親和的寡核苷酸序列,可以特異性結合靶分子,具有良好的穩(wěn)定性和選擇性[19,20].含有鳥嘌呤富集(G)重復結構的G-四聯(lián)體模型可與Pb2+形成G4-Pb2+結構的熒光生物傳感器,用于檢測Pb2+,但這種方法需要進行熒光分子標記[21～23].本文構建了基于硫代黃素T(ThT)熒光分子誘導G-四聯(lián)體結構變化的生物傳感器用于檢測鉛離子(見Scheme 1),無需事先進行ThT熒光分子化學修飾[24,25].ThT是一種市售的水溶性熒光染料,可以特異性地與G-四聯(lián)體結合[26～32].通常,ThT在自由狀態(tài)下是弱熒光的,當溶液中存在G-四聯(lián)體時,ThT會與G-四聯(lián)體結合導致熒光增加.因此,選用富含G的Pb2+核酸適配體(P1: 5′-AGGTTGGTGTGGTTGGA-3′)作為G-四聯(lián)體.當溶液中存在Pb2+時,由于Pb2+和鳥嘌呤堿基之間的高特異性相互作用,最初形成的Pb2+適配體/ThT復合物被Pb2+適配體/Pb2+復合物所取代,從而誘導ThT的釋放并伴隨著熒光信號的降低.

Scheme 1 Scheme of the fluorescence Pb2+ aptasensor based on G-quadruplex formation

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

寡核苷酸序列(P1: 5′-AGGTTGGTGTGGTTGGA-3′)由生工生物科技(上海)有限公司通過HPLC合成和純化; 三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Aladdin試劑公司; Pb(NO3)2,Hg(NO3)2,HNO3,AlCl3,CuCl2,MnCl2,NiCl2,MgCl2,ZnCl2,FeCl2,HCl,NaCl及LiCl均購自國藥集團化學試劑有限公司(上海); 所用試劑未經(jīng)進一步純化直接使用; 超純水由Millipore Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Billerica公司)制備,電阻率>18.25 MΩ·cm.

日本日立公司F-7000型熒光分光光度計,激發(fā)和發(fā)射狹縫分別設定為5和10 nm,用425 nm的最大激發(fā)波長掃描樣品,掃描范圍460～600 nm; 德國Eppendorf公司ThermoMixer F型恒溫振蕩儀; 美國安捷倫公司7900型電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)儀.

1.2 實驗方法

實驗所用緩沖液均為10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH=8.3),其中包含2 mmol/L MgCl2[33,34],儲藏于-20 ℃冰箱中.備用的Pb2+,Hg2+和Ag+儲存在0.5%的HNO3溶液中,其它金屬離子儲存在0.5%的HCl溶液中,以防水解.

Pb2+離子的檢測: 在一定量的10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3,2 mmol/L MgCl2)緩沖液中,加入10 μL 10.0 μmol/L核酸適配體P1,再加入5 μL 1.0 mmol/L ThT熒光分子,然后加入不同濃度的Pb2+溶液,使溶液最終體積為500 μL.將反應體系置于孵育器中在室溫下反應20 min后,用熒光分光光度計測定熒光值,激發(fā)波長為425 nm,最大發(fā)射波長為500 nm,在460～600 nm波長范圍內收集熒光數(shù)據(jù),根據(jù)譜圖分析熒光強度與Pb2+濃度的關系.

2 結果與討論

2.1 檢測Pb2+的可行性

Fig.1 Fluorescence emission spectra of different samples in 10 mmol/L Tris-HCl buffer(pH=8.3) containing 2 mmol/L MgCl2 a. Only 10 μmol/L ThT; b.10 μmol/L ThT+1 μmol/L Pb2+; c.10 μmol/L ThT+100 nmol/L Pb2+aptamer; d.10 μmol/L ThT+100 nmol/L Pb2+ aptamer+1 μmol/L Pb2+; e.buffer.

如圖1所示,當10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3,2 mmol/L MgCl2)緩沖溶液中只有ThT存在時,熒光強度很弱(圖1譜線a); 加入Pb2+后,熒光強度同樣很弱(圖1譜線b); 體系中只有Pb2+適配體和ThT存在時,Pb2+適配體與ThT復合物的形成使熒光強度增高(圖1譜線c); 加入Pb2+后由于Pb2+適配體與Pb2+的高特異性結合,使ThT熒光分子被Pb2+取代而進入溶液,此時熒光強度明顯降低(圖1譜線d).因此,此方法可以測定溶液中的Pb2+.

2.2 實驗條件的優(yōu)化

實驗中使用10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.3),其中含有濃度為2 mmol/L的Mg2+.在此條件下,優(yōu)化了Pb2+適配體濃度、 ThT熒光分子濃度及反應時間3個主要影響因素.首先,優(yōu)化了Pb2+適配體的濃度.由圖2(A)可見,熒光強度降低比值(F0-F)/F(F0和F分別為加入Pb2+前后的熒光值)隨著Pb2+適配體濃度的增加而升高.Pb2+適配體濃度為200 nmol/L時,熒光強度不再顯著增加.因此,本文選擇200 nmol/L作為最佳的Pb2+適配體濃度.其次,優(yōu)化了ThT熒光分子的濃度.圖2(B)顯示熒光強度降低比值(F0-F)/F隨著ThT濃度的增加而升高,并且ThT濃度為10 μmol/L時接近平臺值.因此,實驗選擇10 μmol/L作為最佳的ThT濃度.最后,考察了反應時間的影響.圖2(C)示出了檢測波長為500 nm時的熒光強度,可見,反應10 min后,熒光強度幾乎無變化,故選擇反應時間為10 min.綜上,最佳檢測條件為200 nmol/L Pb2+適配體,10 μmol/L ThT,反應時間為10 min.

Fig.2 Optimization of experimental conditions (A) Effect of the concentration of Pb2+ aptamer(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,2 mmol/L MgCl2,10 μmol/L ThT+1 μmol/L Pb2+); (B) effect of the concentration of ThT(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,2 mmol/L MgCl2,200 nmol/L Pb2+ aptamer); (C) effect of incubation time on fluorescence reduction(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,2 mmol/L MgCl2,200 nmol/L Pb2+ aptamer+10 μmol/L ThT+1 μmol/L Pb2+).

2.3 Pb2+傳感器的靈敏度

在最佳實驗條件下,采用濃度分別為0,0.02,0.1,0.5,1,1.5,2.5,5,6,8,10,25,50,100 μmol/L的Pb2+溶液進行熒光分析,每個濃度平行測定3次.測定結果(圖3)表明,隨著溶液中Pb2+濃度的增加,體系的熒光響應強度逐漸下降,這歸因于Pb2+適配體/ThT復合物被Pb2+適配體/Pb2+復合物所取代,導致ThT被釋放,ThT熒光分子在水溶液中處于自由狀態(tài)時,呈現(xiàn)很弱的熒光.在最大發(fā)射波長500 nm處,Pb2+濃度(20～1000 nmol/L)與對應的熒光強度呈現(xiàn)良好的線性相關(見圖4),線性方程為Y=-3.196X+1310.486,R2=0.9941.根據(jù)3倍標準偏差(3σ)規(guī)則得出檢出限為1 nmol/L.

Fig.3 Fluorescence emission spectra of ThT in the presence of increasing amounts of Pb2+ c(ThT): 10 μmol/L; c(Pb2+ aptamer): 200 nmol/L.

Fig.4 Fluorescence spectra of the proposed platform at 500 nm vs. Pb2+ concentration Inset: dependence of fluorescence intensity on the Pb2+ concentration.

2.4 特異性實驗

為了進一步考察該傳感器的選擇性,在相同條件下對其它金屬離子包括Na+,Li+,Al3+,Zn2+,Mn2+,Fe2+,Mg2+,Cu2+和Hg2+進行了測試.在10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3,2 mmol/L MgCl2)緩沖溶液中,加入200 nmol/L Pb2+適配體,10 μmol/L ThT,1 μmol/L Pb2+以及濃度均為1 μmol/L的其它金屬離子進行實驗,平行測定3次.由圖5(A)可見,除Hg2+外,其它離子對Pb2+測定基本無干擾.因此,進一步分析了Hg2+對Pb2+檢測的干擾.圖5(B)為加入Hg2+掩蔽劑SCN-后測得的干擾情況,可見Hg2+對Pb2+檢測的干擾很小.綜上,該傳感器對Pb2+具有良好的特異性.另外,對比文獻[15～19]報道的熒光傳感器或納米粒子對Pb2+的檢測結果(見表1)發(fā)現(xiàn),本文構建的生物傳感器檢測Pb2+的檢出限(LOD)較低(1 nmol/L)、 時間較短(10 min).

Fig.5 Selectivity of the proposed method for Pb2+ detection Without(A) and with(B) masking reagent SCN- for Hg2+.The concentrations of the Pb2+ analogues were 1 μmol/L in the presence of 200 nmol/L Pb2+ aptamer and 10 μmol/L ThT,while the concentration of Pb2+ was 1 μmol/L.The blank was the sample without Pb2+ and only contains 200 nmol/L ATP aptamer and 10 μmol/L ThT.

Table 1 Comparison of analytical methods for the detection of Pb2+

MethodLOD/(nmol·L-1)Time/minRef. Gold Nano Alloy96 20 [15]Phage-AuNPs45 70 [16]DNA aptamers60.760 [17]Gold nanoparticles1320[18]DNA aptamers3.022 [19]G-quadruplex1.0 10This work

2.5 實際樣品中Pb2+的檢測

將該傳感器用于檢測自來水中的Pb2+含量,平行測定3次,測得樣品中的Pb2+含量為1.6 nmol/L.對同一樣品用ICP-MS檢測,平行測定3次,測得樣品中Pb2+含量為1.5 nmol/L.利用該生物傳感器檢測自來水樣中Pb2+的回收率列于表2,采用標準加入法平行測定3次,相對標準偏差(RSD)均低于5.0%,回收率較好.綜上,所構建的生物傳感器可用于分析實際水樣中的Pb2+.

Table 2 Determination of Pb2+ in real samples

3 結 論

構建了一種基于ThT熒光分子誘導G-四聯(lián)體檢測Pb2+的熒光傳感方法.與化學標記的熒光探針相比,該方法中的Pb2+適配體探針無需化學修飾,具有成本低、 靈敏度高、 操作簡單、 檢出限低及耗時短等優(yōu)點.