李文飛，王鳳霞*，胡國(guó)濤，楊曉健，張 丹

（1.中低品位磷礦及伴生資源高效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550016；2.甕福（集團(tuán)） 有限責(zé)任公司，貴州 貴陽(yáng) 550000）

微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、水分六大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而無(wú)機(jī)鹽主要可為微生物提供除碳源、氮源以外的各種重要元素，在微生物發(fā)酵的作用是構(gòu)成菌體細(xì)胞成份，作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH、氧化還原電位等，對(duì)發(fā)酵菌體的影響效果雖不及碳源和氮源，但適量的添加可促進(jìn)菌體健康快速的生長(zhǎng)繁殖，提高其代謝產(chǎn)物量[1～2]。磷常以磷酸鹽的形式加入到培養(yǎng)基中，據(jù)市場(chǎng)調(diào)研，在微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，考慮到用量大，混合難度等問(wèn)題，大部分微生物發(fā)酵廠家多使用食品級(jí)磷酸代替磷酸鹽。因此，磷酸也可為對(duì)微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵提供磷源。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[3]（GB2760-2014） 中食品工業(yè)用加工助劑使用中明確規(guī)定，磷酸可作為食品工業(yè)用加工助劑（發(fā)酵用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）在發(fā)酵工藝上使用。而根據(jù)生產(chǎn)方式的不同，市面上磷酸產(chǎn)品又分為熱法磷酸（Thermal method phosphoric acid,以下簡(jiǎn)稱(chēng) TPA）和濕法磷酸 （Wet phosphoric acid，簡(jiǎn)稱(chēng) WPA）兩類(lèi)。由于WPA雜質(zhì)較多需經(jīng)凈化處理后才能達(dá)到與熱法磷酸相同品質(zhì)，由此產(chǎn)生了濕法凈化磷酸產(chǎn)品（Purified Wet Phosphoric Acid,以下簡(jiǎn)稱(chēng)PPA）。為探究磷源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)及代謝的影響，本試驗(yàn)選取了以磷酸鹽形式添加的磷源、以濕法凈化磷酸形式添加的磷源、和以熱法磷酸形式添加的磷源，添加入枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料及試劑

試驗(yàn)菌種：枯草芽孢桿菌（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌種保存室提供）。

試劑：食品添加劑濕法磷酸（85%）、食品添加劑熱法磷酸（85%）、磷酸二氫鉀、酵母粉、蛋白胨、瓊脂、牛肉膏、氫氧化鈉，氫氧化鉀、碳酸鈣、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、可溶性淀粉、碘粒、碘化鉀等，以上試劑均為分析純。

培養(yǎng)基及試劑配制：《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第四版）》[4]進(jìn)行配制。

LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基（蛋白胨10g、酵母提取物5 g、葡萄糖5g、氯化鈉10g、瓊脂10g、碳酸鈣0.25g，加純水至 1000mL，pH調(diào)節(jié) 7.2～7.4（1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)） 121℃，高壓滅菌30min）。LB磷酸鹽培養(yǎng)基（在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀0.35g），LB磷酸培養(yǎng)基（在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸0.29g，氫氧化鉀0.15g)

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g，加純水至1000 mL，調(diào)節(jié) pH至 7.0（1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)）121℃，高壓滅菌30min。

固體培養(yǎng)基配制：按照以上配方，每1000mL培養(yǎng)基中加入即可。

1.2 主要儀器和設(shè)備

精密天平；立式壓力蒸汽滅菌鍋（BXM-30R）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (DHP-9052B)；超凈工作臺(tái)（帶紫外燈）；偏光顯微鏡；石墨加熱板（DBXAB）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（PE Lambda）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌固體培養(yǎng)

用接種針挑取已活化好的枯草桿菌點(diǎn)接于LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LB磷酸鹽培養(yǎng)基、LB熱法磷酸培養(yǎng)基、LB濕法磷酸培養(yǎng)基中間，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量單菌落直徑大小。

1.3.2 枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)

微生物類(lèi)生長(zhǎng)狀況可根據(jù)發(fā)酵液中細(xì)胞含量（通常采取比濁法進(jìn)行OD值檢測(cè)，OD值與細(xì)胞含量成正相關(guān)）進(jìn)行判斷。

1）取活化好的菌落斜面一支，以1mL0.9%生理鹽水沖洗菌苔，待完全沖洗干凈后，吸取1mL接種到250mL LB液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37℃、120 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器，培養(yǎng)24h即得酵母種子液。

2）各試驗(yàn)組的LB液體培養(yǎng)基配制好后按照試驗(yàn)要求分裝于500mL三角錐瓶中，每瓶250.00g，標(biāo)注后滅菌備用。

3）接種種子液。按接種量為4%接種于三角錐瓶中，置于37℃、120 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)48h。

4）生長(zhǎng)量測(cè)定。采用比濁法進(jìn)行測(cè)定。以未接種的LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)600 nm條件下，測(cè)定OD值。

1.3.3 枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力[5]

枯草芽孢桿菌在代謝繁殖過(guò)程中能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶、木聚糖酶等十幾種酶而具有很強(qiáng)的降解活性。本試驗(yàn)選取淀粉酶進(jìn)行檢測(cè)，以透明圈直徑大小做為檢測(cè)指標(biāo)，用以驗(yàn)證不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌在產(chǎn)蛋白酶能力上是否存在影響。將試驗(yàn)1.3.1中在四種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌落使用接種針點(diǎn)接于淀粉培養(yǎng)基上，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。通過(guò)淀粉培養(yǎng)基觀察產(chǎn)淀粉酶的能力，該培養(yǎng)基一般無(wú)色透明，滴加盧哥氏碘液，輕搖平皿，使碘液鋪滿(mǎn)培養(yǎng)基表面，等待片刻，培養(yǎng)基中未被降解的淀粉酶遇碘變藍(lán)，菌落周?chē)矸郾唤到獾牡胤匠霈F(xiàn)透明圈，最后采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落及透明圈直徑大小。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS17.0軟件中對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多重比較（LSD）確定組間差異，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，標(biāo)注相同字母（P＞0.05） 表示無(wú)差異，標(biāo)注不同字母（P<0.05） 表示存在差異，EXCEL軟件作表。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)見(jiàn)圖1所示。

不同培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)示意圖

表1 不同培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)48h后，不添加磷源、添加磷酸鹽、添加TPA、添加PPA的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌直徑分別為7.579mm、10.021mm、11.051mm、11.363mm，比不添加磷源的分別增大2.244mm、3.472mm、3.784mm;發(fā)酵液中 OD值分別為 2.452、2.561、2.563、2.556，比不添加磷源的分別增加0.141、0.111、0.104。

2.2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力

由圖2、表2可知，從1#、2#、3#、4#固體培養(yǎng)基中挑取的枯草芽孢桿菌在淀粉培養(yǎng)基上的透明圈直徑、產(chǎn)淀粉酶菌落直徑、產(chǎn)淀粉酶透明圈直徑/菌落直徑值上不存在顯著性差異，由此說(shuō)明培養(yǎng)基中添加適量磷酸鹽、TPA和PPA對(duì)枯草芽孢產(chǎn)淀粉酶能力不會(huì)產(chǎn)生抑制。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)在枯草芽孢培養(yǎng)基中不添加磷源、以磷酸鹽形式添加磷源、以TPA形式添加磷源、以PPA形式添加磷源，培養(yǎng)48h后各指標(biāo)變化來(lái)判斷磷源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知添加磷源，可促進(jìn)枯草芽孢生長(zhǎng)；而以磷酸鹽形式和以TPA、PPA形式添加磷源，都能夠?yàn)榭莶菅挎邨U菌的生長(zhǎng)提供磷源，且促進(jìn)效果一致。

圖2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力

表2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶結(jié)果