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        烏龍茶多糖脫色和脫蛋白工藝研究

        2020-05-18 02:01:06黃秀紅劉麗辰阮懌航彭啟良程博思林金科
        廣東茶業(yè) 2020年2期
        關(guān)鍵詞:方法

        黃秀紅 劉麗辰 阮懌航 彭啟良 程博思 林金科,2*

        (福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建 福州 350002;福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院,福建 福州 350002)

        茶多糖是茶葉中一種有效成分,具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、清除自由基、抗疲勞、抗凝血、抗血栓作用、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抑菌、抗病毒活性等功能[1-4]。

        茶葉粗多糖中含有蛋白質(zhì)等多種雜質(zhì),因此需要進(jìn)行脫蛋白處理。目前常采用的脫蛋白方法有酶法、Savage法、NaOH 法、三氟三氯乙烷法、等電點(diǎn)法、陰離子交換樹(shù)脂法、三氯乙酸法等[5-8]。

        茶葉中含有多種色素,其中多酚類物質(zhì)在多糖的提取分離中影響最大,酚類物質(zhì)容易氧化,對(duì)茶多糖的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理具有重要的影響,所以需要對(duì)茶多糖進(jìn)行脫色處理[9]。目前植物多糖常用的脫色方法有活性炭法、過(guò)氧化氫法、纖維素層析法、分級(jí)沉淀法、大孔樹(shù)脂脫色法等方法[6,10-11]。

        為了獲得更高多糖提取率尋求安全綠色環(huán)保茶多糖脫色脫蛋白工藝,本實(shí)驗(yàn)以烏龍茶多糖為研究對(duì)象,比較活性炭、木瓜蛋白酶、AB-8樹(shù)脂、D101樹(shù)脂、PHD500樹(shù)脂的脫色脫蛋白效果,篩選出安全的烏龍茶多糖脫色脫蛋白方法,為茶多糖的提取純化提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        烏龍茶:購(gòu)買于福建惜緣茶葉有限公司;考馬斯亮蘭試劑盒:南京建成生物工程研究所;D-半乳糖醛酸:上海麥克林生物化學(xué)有限公司;雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒:索萊寶生物科技有限公司;木瓜蛋白酶:北京Solarbio公司;AB-8樹(shù)脂、D-101樹(shù)脂、 PHD-500樹(shù)脂、活性炭:鄭州勤實(shí)科技有限公司;無(wú)水乙醇、重蒸苯酚、濃硫酸、乙酸乙酯、葡萄糖;購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑有限公司,以上試劑均為分析純。

        恒溫水浴鍋(HH-6):國(guó)華電器有限公司;水浴搖床(MQS-30S):旻泉儀器有限公司;電子天平(GL-124-1SCNsartorius):上海精天電子儀器有限公司;可見(jiàn)分光光度計(jì)(721N):上海精密科學(xué)儀器有限公司;真空冷凍干燥機(jī) (LGJ-12):北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 粗烏龍茶多糖的制備

        將干燥的烏龍茶用高速粉碎機(jī)粉碎,過(guò)80目篩,放冰箱備用。精確稱取2.00 g茶粉于離心管中,按料液比1:20 g/mL的比例加蒸餾水,于60℃下恒溫浸提,用抽濾機(jī)抽濾,再用高速離心機(jī)離心30 min(3500 r/min)取上清液,將上清液濃縮,加入5倍體積的無(wú)水乙醇,靜置過(guò)夜,次日離心30 min(3500 r/min)收集沉淀,分別用無(wú)水乙醇、乙酸乙酯洗滌沉淀,每次洗滌充分?jǐn)嚢?,最后高速離心機(jī)離心30 min(3500 r/min)取沉淀,將沉淀置于真空冷凍干燥機(jī)中,得到粗烏龍茶多糖,粗多糖的得率為4.63%。

        1.2.2 脫色工藝的研究

        1.2.2.1 活性炭脫色 參照劉力萍[7]的方法進(jìn)行略微修改。

        1.2.2.2 大孔樹(shù)脂脫色

        大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 參照馬若影[10]的方法進(jìn)行大孔樹(shù)脂的預(yù)處理。

        篩選最佳大孔樹(shù)脂 參照馬若影[10]的方法進(jìn)行。

        1.2.2.3 測(cè)定方法 按照馬若影[10]的方法進(jìn)行。

        1.2.2.4 脫色效果評(píng)價(jià)方法 參照劉力萍等[7]的方法進(jìn)行。

        1.2.3 脫蛋白工藝研究

        1.2.3.1 木瓜蛋白酶脫蛋白 參照陳麗娟[13]的方法進(jìn)行。

        1.2.3.2 大孔樹(shù)脂脫蛋白 參照馬若影[10]的方法進(jìn)行并稍微修改。

        1.2.3.3 測(cè)定方法

        蛋白脫除率 根據(jù)考馬斯亮蘭試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

        1.2.3.4 脫蛋白效果評(píng)價(jià)方法 參照賈文聰?shù)萚14]的方法進(jìn)行。

        1.2.4 茶多糖化學(xué)成分分析

        中性糖含量的測(cè)定 參照苯酚-硫酸法[12]進(jìn)行測(cè)定。

        蛋白質(zhì)含量的的測(cè)定 根據(jù)雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)的方法,于波長(zhǎng)540nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

        糖醛酸含量的測(cè)定 參照邵淑宏[6]的方法測(cè)定。

        1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法

        所有的試驗(yàn)均平行重復(fù)3次,使用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其中p<0.05具有顯著性差異,p<0.01具有極顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同脫色方法對(duì)烏龍茶多糖脫色效果差異分析

        2.1.1 活性炭脫色

        在0.03-0.12g/mL時(shí),隨著活性炭用量的增加,烏龍茶多糖的脫色率先快速增加后緩慢增加,而多糖保留率逐漸減少(見(jiàn)圖1)。當(dāng)活性炭用量在0.03-0.06 g/mL時(shí),脫色率增加明顯,在0.06-0.12 g/mL時(shí),脫色率增加緩慢,但是多糖保留率下降較快。當(dāng)活性炭用量為0.06g/mL,烏龍茶多糖的脫色率為72.11%,多糖的保留率為39.62%。因此,活性炭的最佳用量為0.06 g/mL。

        圖1 活性炭用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

        2.1.2大孔樹(shù)脂脫色

        當(dāng)AB-8樹(shù)脂在0.2-0.8g/mL時(shí),隨著樹(shù)脂用量的增加,烏龍茶多糖的脫色率在上升,多糖保留率在下降(見(jiàn)圖2)。當(dāng)樹(shù)脂在0.2-0.6g/mL時(shí),脫色率增加緩慢,多糖保留率明顯下降。在0.6-0.8g/mL時(shí),脫色率增加緩慢,且多糖保留率低。當(dāng)樹(shù)脂用量在0.2g/mL時(shí),烏龍茶多糖的脫色率為26.99%,多糖的保留率為67.44%。綜合來(lái)看,AB-8樹(shù)脂的最佳用量為0.2g/mL。

        圖2 AB-8樹(shù)脂用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

        當(dāng)D101樹(shù)脂在0.2-0.8g/mL時(shí),隨著樹(shù)脂用量的增加,烏龍茶多糖的脫色率先緩慢增加后快速增加,而多糖保留率逐漸減少(見(jiàn)圖3)。當(dāng)樹(shù)脂用量在0.2g/mL時(shí),烏龍茶多糖的脫色率為19.04%,多糖的保留率為69.67%。此時(shí),樹(shù)脂用量少,但是脫色率效果較好,且多糖率較高。綜合來(lái)看,D101樹(shù)脂的最佳用量為0.2g/mL。

        圖3 D101樹(shù)脂用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

        在0.2-0.8g/mL時(shí),隨著樹(shù)脂用量的增加,烏龍茶多糖的脫色率先緩慢增加后快速增加,而多糖保留率逐漸減少(見(jiàn)圖4)。當(dāng)樹(shù)脂用量在0.2g/mL時(shí),烏龍茶多糖的蛋白脫除率為23.19%,多糖的保留率為70.78%。此時(shí),樹(shù)脂用量少,但是脫色率效果較好,且多糖率較高。綜合來(lái)看,樹(shù)脂PHD500的最佳用量為0.2g/mL。

        圖4 PHD500樹(shù)脂用量對(duì)茶多糖脫色率的影響

        2.1.3不同脫色方法脫色效果評(píng)價(jià)

        以脫色率和多糖保留率為指標(biāo),比較四種脫色劑的脫色效果。結(jié)果如表1,活性炭的脫色率最好(P<0.05),但是多糖保留率也最低(P<0.05);AB-8樹(shù)脂的脫色率低于活性炭(P<0.05),高于D101樹(shù)脂(P<0.05)和PHD500樹(shù)脂,但是多糖保留率低于活性炭(P<0.05)、D101樹(shù)脂和PHD500樹(shù)脂(P<0.05)。D101樹(shù)脂的脫色率最低,與活性炭、AB-8樹(shù)脂和PHD500樹(shù)脂差異顯著(P<0.05)。從加權(quán)評(píng)分法分析可以看出活性炭的評(píng)分最高,PHD500樹(shù)脂次之。但是從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),用活性炭脫色過(guò)程中會(huì)有黑色素殘留。綜合考察,選擇PHD500樹(shù)脂對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫色處理。

        表1 4種脫色方式脫色結(jié)果比較

        2.2 不同脫蛋白方法對(duì)烏龍茶多糖脫蛋白效果差異分析

        2.2.1 木瓜蛋白酶脫蛋白

        當(dāng)木瓜蛋白酶添加量在2-8%時(shí),隨著酶添加量的增加蛋白脫除率在上升,多糖保留率在下降(見(jiàn)圖5)。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量在2-6%時(shí),蛋白脫除率有明顯的增加。在6-8%時(shí),蛋白脫除率仍有增加,并且多糖保留率下降緩慢。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為8%時(shí),烏龍茶多糖的蛋白脫除率為56.03%,多糖的保留率為56.85%。因此,木瓜蛋白酶的最佳添加量為8%。

        圖5 木瓜蛋白酶添加量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

        2.2.2 大孔樹(shù)脂脫蛋白

        當(dāng)AB-8樹(shù)脂用量在0.2-0.8g/mL時(shí),隨著樹(shù)脂用量的增加,多糖保留率下降(見(jiàn)圖6)。當(dāng)樹(shù)脂用量在0.2g/mL時(shí),烏龍茶多糖的蛋白脫除率為57.76%,多糖的保留率為66.44%。此時(shí),樹(shù)脂用量少,但是脫色率效果較好,且多糖率較高。綜合來(lái)看,樹(shù)脂AB-8的最佳用量為0.2g/mL。

        圖6 AB-8樹(shù)脂用量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

        當(dāng)D101樹(shù)脂在0.2-0.8g/mL時(shí),隨著樹(shù)脂用量的增加蛋白脫除率在上升,多糖保留率在下降(見(jiàn)圖7)。當(dāng)樹(shù)脂用量在0.8g/mL時(shí),烏龍茶多糖的蛋白脫除率為51.19%,多糖的保留率為49.99%。此時(shí),樹(shù)脂用量少,但是脫色率效果較好,且多糖率較高。綜合來(lái)看,樹(shù)脂D101的最佳用量為0.8g/mL。

        圖7 D101樹(shù)脂用量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

        當(dāng)PHD500樹(shù)脂在0.2-0.8g/mL時(shí),隨著樹(shù)脂用量的增加蛋白脫除率在上升,多糖保留率在下降(見(jiàn)圖8)。當(dāng)樹(shù)脂在0.2-0.4g/mL時(shí),蛋白脫除率增加緩慢,多糖保留率下降明顯。在0.4-0.8g/mL時(shí),雖然蛋白脫除率增加快,但是多糖保留率低。當(dāng)樹(shù)脂用量在0.2g/mL時(shí),烏龍茶多糖的蛋白脫除率為15.48%,多糖的保留率為66.86%。因此,樹(shù)脂PHD500的最佳用量為0.2g/mL。

        圖8 PHD500樹(shù)脂用量對(duì)茶多糖蛋白脫除率的影響

        2.3 不同脫蛋白方法脫蛋白效果評(píng)價(jià)

        以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo),比較四種脫蛋白方法。結(jié)果如表2,木瓜蛋白酶的蛋白脫除率低于AB-8樹(shù)脂,多糖保留率高于D101樹(shù)脂;AB-8樹(shù)脂的蛋白脫除率最好,但是多糖保留率低于PHD500樹(shù)脂(P<0.05);D101樹(shù)脂的蛋白脫除率低于木瓜蛋白酶和AB-8樹(shù)脂(P<0.05),且D101樹(shù)脂的多糖保留率最低(P<0.05);PHD500樹(shù)脂的蛋白脫除率最低(P<0.05),但是多糖保留率最好(P<0.05)。從加權(quán)評(píng)分法分析可以看出AB-8樹(shù)脂的評(píng)分最高。因此,選擇AB-8樹(shù)脂對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫蛋白處理。

        表2 4種脫蛋白方式脫蛋白結(jié)果比較

        2.4 茶多糖化學(xué)成分分析結(jié)果

        為確定烏龍茶多糖的理化指標(biāo),選取蛋白質(zhì)、中性糖、和糖醛酸3個(gè)指標(biāo),計(jì)算各理化指標(biāo)的含量(見(jiàn)表3)。由表3可知,烏龍茶多糖中蛋白質(zhì)含量為18.04%,中性糖含量為33.23%,糖醛酸含量為39.35%,表明茶多糖中主要為中性糖和糖醛酸,并且含有蛋白質(zhì)。

        表3 烏龍茶多糖的化學(xué)成分

        3 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)以脫色率和脫色率與多糖保留率為指標(biāo),通過(guò)比較4種脫色劑對(duì)烏龍茶多糖進(jìn)行脫色,確定PHD500樹(shù)脂的脫色率效果最好,脫色率效果評(píng)分最高;以蛋白脫除率和多糖保留率為指標(biāo),對(duì)4種脫蛋白方法進(jìn)行比較,確定AB-8樹(shù)脂的脫蛋白效果最好,蛋白脫除率效果評(píng)分最高。AB-8是弱極性樹(shù)脂,比較適用于弱極性物質(zhì)的提取分離和純化,PHD500是極性樹(shù)脂,面對(duì)極性大的物質(zhì)吸附能力較強(qiáng),而色素和蛋白的極性較強(qiáng)。綜合考慮,選用AB-8為了提高脫色率、脫蛋白率的效果,節(jié)省材料,減少多糖損失率和簡(jiǎn)化工藝流程,確定采用AB-8樹(shù)脂用于烏龍茶多糖脫色脫蛋白工藝,可以為烏龍茶多糖在分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定等方面的進(jìn)一步發(fā)展提供相應(yīng)的技術(shù)支持。

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