勾 玲 唐 珍 蘇春藍 姚水蓮 盧海嘯*
(1.玉林師范學院 廣西玉林 537000;2.桂林旅游學院)
牛大力是豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤Millettia Speciosa Champ.的干燥根[1],俗稱山蓮藕、血藤、大力薯等。在兩廣地區(qū)廣泛用作煲湯原料,是“舒筋健腰丸”“壯腰健腎丸”等十余種名優(yōu)中成藥的原料藥[2,3]。而目前對牛大力的研究主要集中于栽培[4]、多糖提取[5]、藥理活性[6]等方面,黃酮類成分加熱回流提取方面尚未見報道。本文以芒柄花素含量[7]和浸膏得率為指標優(yōu)選牛大力黃酮類成分的最佳提取條件,為提高牛大力黃酮提取效率提供參考。
材料:牛大力藥材飲片(廣西泰嶸藥業(yè)有限公司,170201);芒柄花素標準品(上海源葉生物,F(xiàn)27J7S18516,純度≥98%);乙腈、甲醇(色譜純);冰已酸(分析純);乙醇(工業(yè)乙醇)。
儀器:高效液相色譜儀(島津);Inersustrain C18 柱;智能數(shù)顯恒溫水浴鍋;電熱恒溫鼓風干燥箱;數(shù)控超聲清洗器;循環(huán)水式多用真空泵;純水機。
2.2.1 芒柄花素含量的測定方法建立及結果
(1)色譜條件
Inersustrain C18 色譜柱,二極管陣列檢測器(PDA),流動相比例為乙腈∶1%冰乙酸(37.2∶62.5),檢測波長:260 nm,流速:1.5 mL/min,柱溫:35℃,進樣體積:10 μL。
(2)標準曲線繪制
精密稱取芒柄花素標準品0.002 5 g,甲醇溶解,定容至25 mL 容量瓶中,配制成0.1 mg/ml 標準品溶液,采用(1)中色譜條件,改變進樣量,設置連續(xù)自動進樣量為 2、4、6、8、10、12 μL,以標準品各進樣量所得峰面積為縱坐標(Y),以進樣量為橫坐標(X),進行線性回歸,得到芒柄花素回歸方程:Y=272625X+29687,R2=0.999 9。表明芒柄花素在該色譜條件下呈良好的線性關系,色譜圖詳見圖1。
圖1 芒柄花素標準品
(3)精密度試驗
?。?)中標準品溶液,采用(1)中色譜條件,連續(xù)進樣6 次,測得峰面積平均數(shù)為:2 749 491.17,標準方差為:5 820.43,相對標準偏差(RSD)為:0.20%,表明儀器精密性良好。同樣的色譜條件下進行重復性試驗、穩(wěn)定性試驗與加樣回收率試驗,RSD 均小于2.0%,方法重復性好,穩(wěn)定性高。
2.2.2 制備供試品溶液制備方法
精密稱取牛大力中粉(過藥典4 號篩)1.001 6 g,加入50%工業(yè)乙醇10 mL,70℃水浴加熱回流提取1 h,提取完冷卻后補足損溶劑。濾紙過濾,取續(xù)濾液,過直徑為0.22 μm 微孔濾膜置1.5 mL 取樣瓶中,供試品中芒柄花素保留時間與對照品一致,出峰時間約在10.3 min。色譜圖詳見圖2。
圖2 供試品中的芒柄花素
(1)芒柄花素含量計算公式
其中,A供—供試品峰面積;A對—對照品峰面積;W—供試品重量,g。
(2)浸膏得率計算公式
其中,M1—干浸膏重量;M2—藥材重量;V—提取液體積,mL。
2.2.3 牛大力提取的單因素試驗方法
牛大力提取的單因素試驗方法詳見表1。
表1 單因素試驗設計
粒度對牛大力提取效果的影響顯著,粗粉、中粉、細粉的浸膏得率(%)分別為 3.16±0.08、4.3±0.133、6.6±0.231,芒柄花素含量(μg/g)分別為 56.76±1.36、64.6±2.65、83.56±2.51。
由試驗結果可知,顆粒越細,提取物的浸膏得率和芒柄花素含量越高。粗粉提取率和芒柄花素含量都較低,而細粉浸膏得率和芒柄花素含量都是最高的,提取時應選擇細粉。
料液比對牛大力提取效果的影響結果詳見表2。
表2 料液比對浸膏得率和芒柄花素含量的影響
由表2 可知,料液比越低,浸膏得率越大,且當料液比為1∶20 時,芒柄花素含量最高。同等條件下,粒度越細,提取溶劑與藥材粉末的比表面積接觸越大,提取越充分,料液比越低,溶解在提取劑中的物質比例越高。從本研究可以看出,粒度越小,料液比越低,提取物浸膏得率都呈明顯上升趨勢,當料液比較低時,增加了料液體系間有效成分的濃度差??紤]到降低能耗和功效成分的有效提取,選擇細粉、1∶20料液比比較合適。
提取溶劑濃度對牛大力提取效果的影響結果詳見表3。
表3 提取溶劑濃度對浸膏得率和芒柄花素含量的影響
由表3 可知,隨著提取溶劑中乙醇含量的增加,提取浸膏得率逐步下降,而芒柄花素是先升高后急劇下降再升高的趨勢,當使用90%工業(yè)已醇提取時,芒柄花素含量達到最大值。牛大力中含有豐富的多糖等水溶性物質,乙醇作為提取溶劑可以除去一些親水性的黏液質、果膠、淀粉和部分多糖及其他水溶性雜質;在乙醇濃度40%~90%時,水溶性浸出物溶出減少,浸膏得率逐步降低,90%乙醇提取時芒柄花素含量是40%乙醇提取的將近1.5 倍??紤]到實際生產效率,選擇80%乙醇進行提取較為合適。
提取溫度對牛大力提取效果的影響顯著,50℃、60℃、70℃、80℃、90℃時的浸膏得率(%)分別為 3.00±0.13、3.44±0.14、2.76±0.12、3.73±0.14、3.70±0.15,芒柄花素含量(μg/g)分別為 74.02±2.94、81.83±2.65、86.51±2.01、90.12±2.55、29.12±1.12。
隨著提取溫度的升高,浸膏得率呈現(xiàn)升高后降低再升高的趨勢,芒柄花素含量在80℃前都呈緩慢上升趨勢,90℃時急劇下降。表明不同的提取溫度對牛大力中芒柄花素的提取有一定的影響,在50℃~80℃內,隨著溫度的升高,芒柄花素的含量呈上升趨勢,在90℃時提取液中芒柄花素含量急劇下降,這可能是芒柄花素的酚羥基在高溫下易被氧化[8,9],導致部分芒柄花素結構受到破壞,因此提取溫度應低于90℃??紤]到實際生產效率及可操作性,選擇80℃作為提取溫度比較合適。
提取次數(shù)對牛大力提取效果的影響顯著,1~5 次提取梯度中,浸膏得率(%)分別為 3.00±0.14、6.78±0.24、7.69±0.22、8.30±0.27、8.26±0.25,芒柄花素含量(μg/g)分別為 85.11±2.64、100.00±3.65、106.00±3.21、110.02±3.55、110.94±2.32。
隨著提取次數(shù)的增加,浸膏得率和芒柄花素含量都逐步升高,在提取4 次與5 次時增幅較小,提取次數(shù)對浸膏得率和芒柄花素含量都有明顯的影響,提取超過3 次后,升高趨勢已不明顯,說明原藥材中芒柄花素等在提取3 次后已接近全部溶出??紤]生產效率和成本問題,選擇提取2 次較為合適。
提取時間對牛大力提取效果的影響顯著,其中1、1.5、2、3、4 h 的浸膏得率(%)分別為 2.91±0.10、2.98±0.14、3.39±0.16、4.12±0.12、2.37±0.09,芒柄花素含量(μg/g)分別為 87.52±2.34、93.78±2.65、87.56±2.31、56.52±2.45、57.43±1.62。
隨著提取時間的延長,浸膏得率在3 h 以前呈上升趨勢,提取時間在4 h 時顯著降低,而芒柄花素含量在1.5 h 提取時間時達到最高,提取時間在1~1.5 h時,芒柄花素含量逐漸增多,超過2 h 后芒柄花素含量急劇降低,可能是長時間高溫加熱狀態(tài)下,芒柄花素的酚羥基被氧化從而造成提取液中芒柄花素含量降低??紤]生產效率和成本問題,選擇提取時間為1.5 h較為合適。
通過對牛大力熱回流提取工藝的單因素考察試驗,最終確定了提取牛大力的最佳工藝條件為:細粉、80%乙醇提取、料液比1∶20、提取溫度80℃、提取時間1.5 h、提取次數(shù)2 次。