譚美齡 張 欽 付 鵬

（重慶市萬州食品藥品檢驗所 重慶 404000）

1 前言

鮮蛋因營養(yǎng)價值豐富，成為人們日常飲食中重要的動物源性食品之一，對其相關藥物殘留量的檢測是食品安全監(jiān)測的剛性需求。氯霉素類和喹諾酮類均為抗生素類藥物，主要有氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）等。五氯苯酚（Pentachlorophenol，PCP）及其鈉鹽為有機氯農藥，常用作殺菌劑、除草劑和殺蟲劑。氯霉素類藥物可影響造血功能并導致貧血。喹諾酮類藥物會影響胃腸道和心血管系統(tǒng)的健康。五氯苯酚通過水載體廣泛擴散，影響生態(tài)安全并產生生物蓄積，可能對人類造成致畸、致癌、致突變和其他危害[1]。

目前，國內外相關檢測方法中，大部分方法需要衍生化[2-4]，采用傳統(tǒng)的固相萃取柱進行凈化，基質效應較難控制，使得靈敏度低，檢測限高，存在假陽性風險，在復雜樣品基質中的應用能力有限。本文在樣品凈化步驟中選用了對鮮蛋中的磷脂和色素類物質具有較好去除能力的Waters Oasis PRiME HLB柱[5，6]，該新型小柱無須活化平衡、淋洗、洗脫，基質干擾物直接吸附于填料內，直接收集濾液待測，簡化了操作步驟，節(jié)省了時間，降低了基質效應；同時，結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）法建立了高靈敏度、快速準確、安全經(jīng)濟的藥物痕量分析法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

標準物質：氯霉素（D015026）、五氯酚酸鈉（170710，100 μg/mL）、氯霉素-D5（161228，100 μg/mL）、環(huán)丙沙星-D8（160414）（北京曼哈格）；氟苯尼考（DRE-C 13665000）、甲砜霉素（DRE-C17457000）、五氯酚-13C6（C15970100）（Dr.Ehrenstorfer）；恩諾沙星（TC180203-07）、環(huán)丙沙星（AL181105-06）（Stanford Chemicals）；恩諾沙星-D5（272238）（WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof）。

主要試劑：甲醇、乙腈（德國Merck 公司）。

2.2 儀器與設備

AB Sciex QTRAP 4500 高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（美國 AB SCIEX 公司）；TG20WS 離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；KQ-800DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DN-12W 氮吹儀（上海楚定分析儀器有限公司）；IKA MS 3 digital 渦旋振蕩器（德國 IKA 集團）。

2.3 實驗方法

2.3.1 標準溶液的配制

取氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星，用甲醇配制成混合標準工作溶液（100 ng/mL）；取恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、五氯酚-13C6，用甲醇配制成混合內標工作溶液（1 μg/mL）；按照最終定容濃度為 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，采用空白樣品基質溶液進行稀釋配制。

2.3.2 樣品制備

取樣：取鮮蛋，去掉外殼，使用勻漿機攪勻，放入干凈的容器中，密封并標記。

提?。悍Q取2 g 樣品至50 mL 離心管內，加入混合內標工作溶液（1 μg/mL）50 μL，加入 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）10 mL，渦旋混合1 min，超聲10 min，8 000 r/min 離心 10 min（溫度小于 5℃）。

凈化：取2mL 上清液，加入到Water Oasis PRiME HLB（6 cc，200 mg）小柱上，使其自然下滴通過，取1 mL 收集到的濾液置于氮吹管中，于40℃下用氮氣吹至近干。將殘余物用初始流動相復溶并定容至1mL，過0.22 μm 微孔濾膜后用于UPLC-MS/MS 測定。

2.3.3 儀器分析

（1）色譜條件

色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2.1×100 mm 1.9-Micron；柱溫：35℃；進樣量：5 μL；流動相：A 乙腈、B 水（含 5 mmol/L 乙酸銨）；流速：0.20 mL/min；梯度洗脫：0～2 min。流動相A 含量為10%并保持2～6 min；流動相A 從10%線性增加至90%，并保持至8 min；8～9 min，流動相 A 從 90%線性回至 10%，并保持至11 min。

（2）質譜條件

離子源：電噴霧型（ESI）；電噴霧電壓：5 500 V/-4 500 V；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；輔助加熱氣：50 units；霧化氣：50 units；反吹氣：30 units；霧化器蒸發(fā)溫度：550℃；掃描方式：正負離子同時切換，相關質譜參數(shù)詳見表1。

表1 質譜參數(shù)

續(xù)表1

3 結果與分析

3.1 提取方法的優(yōu)化

提取過程關系到整個檢驗工作的成敗，6 種化合物中，除了五氯苯酚及其鈉鹽（PCP-Na）為農藥外，其余5 種為獸藥抗生素，均可溶于有機溶劑。根據(jù)這6 種化合物和鮮蛋基質的特性，本文分別選用甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑。實驗發(fā)現(xiàn)，3 種提取劑沉淀蛋白能力乙腈最好，其次為甲醇，產生的絮狀沉淀易于冷凍離心分離。甲醇和乙酸乙酯能萃取出鮮蛋中的脂肪，而乙腈能減少脂肪和其他雜質的溶出，同時破除乳化現(xiàn)象。由于鮮蛋中含有大量水分，部分待測物如PCP-Na 易溶于水中，而乙酸乙酯只能溶解部分水分，不利于將目標物完全提取出來。所以本文選擇與水混溶的乙腈作為提取溶劑，并加入部分極性溶劑水以形成混合提取體系，比較了提取液中乙腈體積分數(shù)分別為 100%、90%、80%、70%和60%時通過固相萃取柱時的提取效率（圖1）。其中，80%的乙腈水提取的回收率最高且提取液更清亮易于后續(xù)的過柱凈化。ENR 和CIP 含有羧基、哌嗪基，兼具弱酸弱堿的性質，在烯酸或稀堿中具有較好的溶解度。在酸性條件下PCP-Na 會酸化成脂溶性的PCP 而被提取出來，PCP 的 pKa=4.93，在酸性條件下形成分子態(tài)，對于增加其在有機溶劑中的分配比更有利。基于以上特性，本實驗在80%乙腈水中添加0.2%的甲酸溶液，作為最終的提取溶劑。

圖1 不同比例提取液對凈化效果的影響

3.2 凈化方法的優(yōu)化

鮮蛋的基質較為復雜，可能會干擾UPLC-MS/MS分析，影響定性定量。同時，還會污染色譜系統(tǒng)和質譜系統(tǒng)。所以，不僅要考慮目標化合物的提取效率，還要考慮在復雜的鮮蛋基質中的干擾物如脂肪、蛋白質、磷脂等的去除率。鮮蛋中的蛋白質通過乙腈沉淀和冷凍離心被去除。傳統(tǒng)的溶劑脫脂步驟可以除去脂肪，但是有機溶劑消耗大，污染環(huán)境，不利于操作人員的健康。本實驗采用固相萃取方法對樣品進行凈化，分別考察了 C18、HLB、PRiME HLB 3 種不同的固相萃取小柱的凈化效果。其中，C18 的平均回收率只有70%～80%，HLB 和 PRiME HLB 均能達到80%～110%。通過質譜掃描不同小柱凈化下的樣品基質溶液，PRiME HLB 的基質干擾峰最少。C18 小柱是一種硅膠反相吸附劑，主要吸附疏水性目標物質，對脂溶性雜質如磷脂和色素，容易形成死體積使作用位點減少，并且小柱易干使目標物保留減少，凈化能力有限。HLB 填料是親水親脂性單體的共聚物，具有高比表面積及強吸附性，也屬于反相吸附機理，能夠克服傳統(tǒng)C18 填料的缺點，除雜能力與C18相比較好，但不能有效去除鮮蛋中的磷脂等干擾物。PRiME HLB 小柱是基于HLB 小柱的升級，同屬反相保留機理，能有效去除鮮蛋中95%以上的基質干擾物，特別是對于脂肪、磷脂和色素的去除效果極好。同時，PRiME HLB 與 C18 和 HLB 小柱相比，無需任何活化、洗脫和淋洗，直接上樣，使得樣品凈化過程更加簡單、快速、有效。

3.3 液相色譜條件的優(yōu)化

本實驗選用具有較小填料內徑（1.9 μm）的色譜柱對目標物進行分離，6 種藥物均有較強的保留，分離較好。使用乙腈作為洗脫流動相，較甲醇的基線平穩(wěn)，峰形更尖銳，響應更高。在ESI 電離模式中，揮發(fā)性的鹽會堵塞取樣孔，沾污透鏡影響聚焦的電位分布，故本實驗使用相對更易揮發(fā)的緩沖鹽乙酸銨來提高目標化合物的電離效率。同時，采用梯度洗脫的方式，適當延長目標物的保留時間，將基質的干擾降到最低。由于ESI 質譜儀是濃度檢測器，流速越小，在一定注射體積下流出峰的濃度越大，同時，低流速下產生的霧滴更利于霧化并增加信號強度。因此，使用0.2 mL/min 的流速并結合液相超高壓技術的應用可以獲得更好的峰形和靈敏度。

3.4 質譜分析條件的優(yōu)化

據(jù)歐盟2002/657/EC 法案的要求[7]，在農藥和獸藥殘留分析中，對于禁用藥物，以質譜法需要達到4 個點的要求。多級質譜的要求是檢測1 個母離子和2 個產物離子，并分別用于定量定性。從質譜調諧可以看出，五氯酚結構非常穩(wěn)定，其分子離子在碰撞室中不易被打碎，很難獲得特征子離子。因此，選擇五氯酚中氯元素的4 個同位素母離子作為質譜確認的識別點：262.6、264.3、266.9、268.7。其余 5 種獸藥在碰撞室中均能被不同程度的打碎。通過全掃描方式觀測離子情況，ENR 和CIP 易獲得H+形成穩(wěn)定的（M+H）+分子離子。CAP、FF、TAP 和 PCP 均為酸性化合物，容易丟失H+以形成穩(wěn)定的（M-H）-分子離子，因此，本實驗采用正負離子同時切換掃描對樣品進行分析。在MS 定量分析時，采用了同位素內標物質，其中，CAP、FF、TAP 以 CAP-D5作為內標物，ENR 以 ENRD5作為內標物，CIP 以 CIP-D8作為內標物，PCP 以PCP-13C6作為內標物，以內標峰面積與目標物峰面積的比率進行定量分析，用于控制樣品提取凈化、LC進樣、流動相和電離等過程的誤差，提高定量的準確性。

3.5 基質效應的考察

在UPLC-MS/MS 中，由共流物引起的基質效應會影響分析方法的靈敏度、精密度和準確度。選取具有代表性的幾種鮮蛋品種，通過對比溶劑標準曲線和空白基質工作曲線的差異，來考察不同鮮蛋基質對試驗結果的影響。通過基質效應（Matrix Effect，ME）計算公式ME=［（基質匹配標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率）-1］×100%進行計算。當 ME＜0 時，表現(xiàn)為基質抑制；當ME＞0 時，表現(xiàn)為基質增強。不同鮮蛋樣品的基質效應詳見表2。由表2 可知，鵪鶉蛋為弱基質增強效應，雞蛋、鴨蛋為中等強度基質增強效應，幾種鮮蛋基質均有增強離子化的效果，所以需要配制基質匹配標準工作曲線來補償基質效應。同時，本實驗還通過稀釋樣品溶液、優(yōu)化凈化步驟、優(yōu)化色譜分離條件共同作用來減少基質對實驗結果的影響。

表2 不同鮮蛋樣品的基質效應（單位：%）

3.6 方法學驗證

3.6.1 線性范圍及檢出限

配制系列基質標準工作溶液，以峰面積對應的質量濃度做工作曲線，每個校準點以隨機順序重復測量2 次，結果詳見表3。6 種化合物在質量濃度在0.2～20 ng/mL 時均具有良好的線性關系。符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[8]所規(guī)定的對于準確定量的方法，即線性回歸方程的相關系數(shù)不小于0.99 的要求。

表3 工作曲線及檢出限

續(xù)表3

3.6.2 回收率及精密度

選用鮮蛋陰性基質樣品，在曲線線性范圍中做標準加入法，分別加入 2.5 μg/kg、5.0 μg/kg、25.0 μg/kg 3 個不同濃度梯度量的標準溶液，按照樣品制備過程同法處理，進行回收率實驗，每次測試重復6 次，CAP 的平均回收率為 98.7%～103.4%，RSD 為 1.6%～3.5%；FF 的平均回收率為 91.5%～95.8%，RSD 為 5.9%～7.8%；TAP 的平均回收率為87.4%～92.2%，RSD 為5.9%～7.3%；ENR 的平均回收率為90.2%～98.2%，RSD 為1.7%～3.5%；CIP 的平均回收率為 94.2%～96.2%，RSD 為1.9%～3.2%；PCP-Na 的平均回收率為 73.2%～75.4%，RSD 為3.1%～8.9%。以上數(shù)據(jù)表明，不同梯度的回收率均符合GB/T 27417—2017 附錄A 規(guī)定的技術要求（濃度水平范圍＜0.1 mg/kg 時，回收率范圍為60%～120%；精密度小于15%）。

4 結論

本文建立了PRiME HLB-UPLC-MS/MS 同時測定鮮蛋中6 種藥物殘留量的方法。結果表明，在本法條件下，優(yōu)化了前處理，提高了準確度和精密度，6種藥物在濃度為0.2～20 ng/mL 時線性良好，適合大批量的日常分析檢測，可為建立同時快速測定獸藥和農藥殘留的研究提供技術支持。