廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 目的：通過(guò)體外染色體畸變?cè)囼?yàn)來(lái)檢測(cè)納米銀敷料引起遺傳毒性的可能性，為臨床前安全性評(píng)價(jià)提供資料與提示。方法：根據(jù)《GB/T16886.3-2008/ISO 1099-3:2014》中推薦的方法選用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL）進(jìn)行體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)（CAT），在代謝活化系統(tǒng)（+S9）與非代謝活化系統(tǒng)（-S9）條件下，檢測(cè)納米銀敷料浸提液在+S9/6h、-S9/6h、-S9/24h三種處理?xiàng)l件下誘發(fā)CHL細(xì)胞的染色體畸變率。結(jié)果：納米銀敷料各處理組的染色體畸變率與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在與CHL接觸24h后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯形態(tài)改變。結(jié)論：在該試驗(yàn)條件下，納米銀敷料浸提液對(duì)CHL細(xì)胞的染色體無(wú)明顯損傷作用，在24h接觸組中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞毒性。

納米材料因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，以及能夠與生物體發(fā)生高度活性的相互作用，廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域，具有廣闊前景。納米銀抗菌醫(yī)用敷料是一種采用納米技術(shù)，以納米級(jí)別的超細(xì)銀顆粒載于醫(yī)用無(wú)菌紗布、非織造布、醫(yī)用脫脂紗布或功能相當(dāng)?shù)钠渌t(yī)用纖維制品組成的醫(yī)療器械。一般分為自粘型和非自粘型兩種類型。其中，無(wú)紡布、紗布或功能相當(dāng)?shù)钠渌t(yī)用纖維制品抗菌敷料分為自粘型和非自粘型兩種類型，脫脂針織紗布抗菌敷料為非自粘型，可用于燒燙傷、手術(shù)切口和皮膚感染傷口的輔助治療。納米銀是一種安全環(huán)保的天然殺菌劑，這種含納米銀的敷料能抑制與之相接觸的病原體，防護(hù)或輔助治療創(chuàng)面感染，從而加速創(chuàng)面愈合。此外由于納米銀敷料能持續(xù)釋放納米銀，可以減少換藥次數(shù)，減輕換藥痛苦，節(jié)約治療成本。納米銀抗菌醫(yī)用敷料對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用[1]。與此同時(shí)，其可能存在的安全風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題也備受關(guān)注。

遺傳毒性試驗(yàn)是非臨床安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容，通過(guò)一系列試驗(yàn)評(píng)價(jià)材料是否有遺傳毒性，對(duì)材料的致癌性有一定的預(yù)測(cè)作用，從而降低人群危害風(fēng)險(xiǎn)。而對(duì)納米材料的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)具有一定的特殊性，納米材料因?yàn)槠涑叽缧?yīng)等特點(diǎn)而易于出入細(xì)胞，并可在細(xì)胞內(nèi)蓄積，與細(xì)胞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生直接或者間接的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還會(huì)引起DNA損傷的增加，不同粒徑的納米銀顆粒影響具有差異[2]。納米材料也易于在肝臟和免疫器官等部位分布蓄積，對(duì)于是否會(huì)因長(zhǎng)期滯留于臟器內(nèi)而誘發(fā)腫瘤也是遺傳毒性研究中需要考慮的一個(gè)因素。由于沒(méi)有單獨(dú)一個(gè)遺傳毒性試驗(yàn)方法可檢測(cè)所有的遺傳毒性終點(diǎn)，遺傳毒性的評(píng)價(jià)大多采用組合試驗(yàn)的方法，國(guó)內(nèi)醫(yī)療器械遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)室一般的試驗(yàn)組合為Ames試驗(yàn)，小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)（MLAT）和體外染色體畸變?cè)囼?yàn)（CAT）[3,4]。體外染色體畸變?cè)囼?yàn)可以直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目進(jìn)行細(xì)微觀察，可以快速直觀判斷染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)變化異常，是最基本、重要的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法之一，具有重要價(jià)值。本文主要介紹以體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)對(duì)納米銀敷料進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

樣品與對(duì)照品：本次體外染色體畸變?cè)囼?yàn)采用三種納米銀敷料產(chǎn)品，分別為樣品A、樣品B、樣品C。這三種產(chǎn)品基本涵蓋了目前臨床上使用的主要納米銀敷料類型，樣品A由無(wú)紡布和敷料海綿組成，樣品B由敷料海綿組成，樣品C由脫脂針織紗布組成。分別用相應(yīng)的浸提介質(zhì)吸足液體后，按照0.2g/mL的比例加入含血清培養(yǎng)基（購(gòu)自Gibco），在37°C條件下浸提48h，所得浸提液為供試品液。陰性對(duì)照（浸提介質(zhì)）為含血清培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照的選擇為在非活化代謝條件下選用甲磺酸甲酯（MMS，購(gòu)自Sigma）作為陽(yáng)性對(duì)照，在活化代謝條件下選用環(huán)磷酰胺（CP，購(gòu)自阿拉丁公司）[5]。

細(xì)胞株和主要儀器：細(xì)胞株為中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（Chinese Hamster Lung Cell，CHL），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；倒置顯微鏡，購(gòu)于Olympus公司；普通光學(xué)顯微鏡，購(gòu)于徠卡公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)，均購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

培養(yǎng)基與試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液由RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液（終濃度1%）、小牛血清（終濃度10%）配制而成，均購(gòu)自Gibco。秋水仙素配制成5mg/mL，稀釋后使用（SIGMA，終濃度1μg/mL）。吉姆薩染液購(gòu)自索萊寶，甲醇購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，冰乙酸購(gòu)自廣州市東紅化工廠。

代謝活化系統(tǒng)：S9由苯巴比妥鈉與β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理大鼠肝而獲得，購(gòu)買于Moltox公司。本試驗(yàn)中所用S9混合液（S9mix）中的S9含量為10%，檢測(cè)時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配，S9與0.2mol/L的PBS、1.65mol/L的KCl、0.4mol/L的MgCl2、0.05mol/L的Glucose-6-Phosphate、0.025mol/L的NADP配制成S9 mix[6]。大鼠肝S9包括肝微粒體和胞質(zhì)酶，是體外遺傳毒性試驗(yàn)常用試劑，用以模仿受試物體內(nèi)代謝活化過(guò)程。然而S9本身有一定細(xì)胞毒性，因此在添加S9進(jìn)行活化的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，給藥處理時(shí)間通常不超過(guò)6h[7]。

1.2 方法

接觸處理：試驗(yàn)前接種一定數(shù)量細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)到近匯合狀態(tài)后棄培養(yǎng)液，加入對(duì)照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足），置于培養(yǎng)箱中?；罨x組接觸6h后吸去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于24h內(nèi)收獲細(xì)胞。非活化代謝組接觸時(shí)間為6h和24h。收獲前4h加入終濃度為1μg/mL秋水仙素。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組同法制備。

收獲細(xì)胞與制片：消化細(xì)胞后加含血清培養(yǎng)液收集細(xì)胞。加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲處理后，加入固定液進(jìn)行固定，固定結(jié)束后離心棄上清，加入數(shù)滴新鮮固定液滴片，空氣干燥后用姬姆薩染液染色。

結(jié)果分析：在光學(xué)顯微鏡下每一試驗(yàn)組選擇200個(gè)分散良好的中期分裂相觀察染色體畸變的情況。在SPSS軟件上采用χ2檢驗(yàn)對(duì)各組染色體畸變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果分析

2.1 細(xì)胞毒性

根據(jù)相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)RICC來(lái)評(píng)估供試品的細(xì)胞毒性，與6h接觸組比較，三種納米銀敷料浸提液接觸24h后的RICC明顯降低，RICC分別為20.4%、31.0%、28.1%（表1），結(jié)果表明CHL細(xì)胞與納米銀敷料浸提液接觸24h后均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞毒性，鏡下觀察表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的變化（圖1），細(xì)胞膨大、變長(zhǎng)、胞內(nèi)小泡顆粒增多，部分細(xì)胞死亡脫落或者固縮變圓。而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和形態(tài)上的改變，細(xì)胞呈梭形，不規(guī)則形狀，胞體貼壁鋪展均勻。

2.2 染色體畸變結(jié)果

納米銀敷料浸提液對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變作用的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入S9混合液與不加S9混合液條件下所誘發(fā)的染色體畸變率均＜5%，其畸變率與陰性對(duì)照組相比差異均無(wú)顯著性。在同一條件下，陽(yáng)性對(duì)照中非代謝活化組的甲磺酸甲酯誘發(fā)產(chǎn)生的畸變率為14.5%（6h）和18.5%（24h），代謝活化組的環(huán)磷酰胺誘發(fā)產(chǎn)生的畸變率為20.5%，與陰性對(duì)照組相比差異均具有顯著性（表1），這表明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成立可靠。另外，三種納米銀敷料各試驗(yàn)組均觀察到多倍體細(xì)胞（圖2）。

式中：RICC——細(xì)胞相對(duì)增長(zhǎng)數(shù)；d1——試驗(yàn)樣品培養(yǎng)物中細(xì)胞的最終數(shù)量；d0——試驗(yàn)樣品培養(yǎng)物中細(xì)胞的起始數(shù)量；D1——對(duì)照品培養(yǎng)物中細(xì)胞的最終數(shù)量；D0——對(duì)照品培養(yǎng)物中細(xì)胞的起始數(shù)量。

3.討論

圖1. 各組接觸24h后鏡下觀察的CHL細(xì)胞形態(tài)（1a：對(duì)照組；1b：樣品組）

圖2. 油鏡下觀察的染色體形態(tài)（2a：多倍體；2b：正常染色體）

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)浸提的方式得到供試品液，以其與CHL細(xì)胞直接接觸，在6h和24h分別收獲細(xì)胞，進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)畸變分析，結(jié)果顯示各試驗(yàn)組的CHL細(xì)胞染色體畸變率與陰性對(duì)照相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)顯著性差異性，且染色體畸變率均＜5%。而陽(yáng)性對(duì)照中非代謝活化組的甲磺酸甲酯和代謝活化組的環(huán)磷酰胺均顯示出明顯的陽(yáng)性反應(yīng)。上述結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)條件下，未檢測(cè)出納米銀敷料浸提液對(duì)CHL細(xì)胞染色體具有明顯的損傷作用。但是研究結(jié)果還顯示納米銀敷料在不同條件處理下均出現(xiàn)了多倍體細(xì)胞，多倍體是體外染色體畸變?cè)囼?yàn)中的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，但僅多倍體產(chǎn)生并不能提示受試物具有誘導(dǎo)非整倍體的潛力，而可能僅提示細(xì)胞周期紊亂[8]；多倍體也常常與細(xì)胞毒性的升高有關(guān)，這也與本實(shí)驗(yàn)計(jì)算出來(lái)的樣品相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)RICC降低相符合。

近年來(lái)，含銀敷料逐漸廣泛應(yīng)用于臨床，銀離子本身帶有抑菌殺菌功能，而納米銀作為一種特殊的銀離子，具有比普通粒徑的銀離子更強(qiáng)效的抑菌作用，在醫(yī)療行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于抗菌類醫(yī)藥和器械。目前對(duì)納米銀敷料的研究主要在于臨床上的使用功效以及安全性等方面，對(duì)于毒理學(xué)方面的研究報(bào)告甚少，尤其是遺傳毒性相關(guān)的方面。

表1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）是體外染色體畸變?cè)囼?yàn)常用的細(xì)胞株之一，由于CHL細(xì)胞株的不同世代之間，在細(xì)胞周期時(shí)間和克隆形成率等參數(shù)上沒(méi)有明顯差異，便于控制實(shí)驗(yàn)條件，且不受動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)及生理、免疫狀態(tài)影響，因而能定量研究，重復(fù)性也好，且能傳代保存，便于進(jìn)行形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)等觀察，并進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)、生物化學(xué)等分析，被廣泛用于染色體畸變?cè)囼?yàn)的研究[9]。在于永生等[10]的研究中曾提出，肺臟是納米銀吸入染毒易損傷的靶器官，因此本研究采用CHL細(xì)胞為研究對(duì)象對(duì)納米銀敷料的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以更好地探索納米銀敷料的細(xì)胞毒性，從而分析細(xì)胞增殖能力與遺傳物質(zhì)損傷之間的潛在聯(lián)系。為了排除因細(xì)胞毒性的影響而可能出現(xiàn)的假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，需要在后續(xù)的試驗(yàn)中設(shè)置不同劑量組計(jì)算納米銀敷料對(duì)CHL細(xì)胞的IC50值，進(jìn)一步對(duì)納米銀敷料的遺傳毒性進(jìn)行深入研究評(píng)價(jià)。這也可以為納米銀產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)以及相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供相應(yīng)依據(jù)。