上海市食品藥品監(jiān)督管理局認證審評中心 （上海 200003）

內(nèi)容提要： 對發(fā)光免疫類體外診斷試劑的不同方法學進行匯總比較，歸納了發(fā)光免疫類體外診斷試劑全生命周期的控制要點以及現(xiàn)場核查中常見問題。

發(fā)光免疫診斷試劑作為比較先進的體外診斷技術(shù)，目前廣泛應用于腫瘤標記物、內(nèi)分泌功能、激素、傳染病等醫(yī)療診斷的領(lǐng)域[1-4]。我國發(fā)光免疫診斷技術(shù)還處于發(fā)展初期，該技術(shù)以及相應的設(shè)備主要由國外企業(yè)如羅氏的電化學發(fā)光技術(shù)、雅培的直接化學發(fā)光技術(shù)以及貝克曼的酶促化學發(fā)光技術(shù)等占據(jù)大部分市場份額。目前，上海已有6家國內(nèi)企業(yè)有該類產(chǎn)品的注冊證，且越來越多的企業(yè)正在注冊申報中。本文通過對現(xiàn)有免疫發(fā)光技術(shù)進行對比分析，提出全生命周期的控制要點及常見現(xiàn)場核查問題匯總。

1.發(fā)光免疫類體外診斷試劑的原理與優(yōu)缺點

發(fā)光免疫類診斷試劑的基本原理是基于高靈敏度的發(fā)光測定技術(shù)與特異性免疫反應相結(jié)合的分析技術(shù)，該方法是由酶聯(lián)免疫發(fā)展而來，但酶聯(lián)免疫存在敏感性相對較低、所用標記酶與底物可定量測定范圍窄、操作繁瑣等缺點，正逐漸被發(fā)光免疫類產(chǎn)品所取代[5]。根據(jù)發(fā)光原理的不同可將發(fā)光免疫診斷試劑大致分為：化學發(fā)光（CLIA）、電化學發(fā)光（ECLI）以及時光分辨化學發(fā)光（TRFIA），每種方法各具優(yōu)勢，同時存在一定的不足，下面逐一對幾種方法進行介紹（見表1）。

1.1 化學發(fā)光法

主要是指參與化學變化的物質(zhì)的發(fā)光劑利用吸收的化學能進行輻射而產(chǎn)生光的現(xiàn)象，主要包括直接化學發(fā)光和酶促化學發(fā)光。直接化學發(fā)光最常見的為吖啶酯/過氧化氫系統(tǒng)，其靈敏度相對較高但同時存在發(fā)光時間短等缺點。酶促化學發(fā)光主要包括辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)、堿性磷酸酶（ALP）系統(tǒng)等。其優(yōu)勢是發(fā)光信號強而穩(wěn)定，且發(fā)光時間較長，但可能會存在工作曲線隨時間漂移的問題。

1.2 電化學發(fā)光

電化學發(fā)光是以三丙胺作為電子供體，用三聯(lián)吡啶釕來標記抗體（抗原）在電場環(huán)境中發(fā)生化學反應。其發(fā)光信號穩(wěn)定，發(fā)光時間長，但同時存在測量方式復雜、儀器維護成本高等缺點。

1.3 時間分辨熒光（TRFIA）

TRFIA是將稀土鑭系離子在抗原（抗體）分子上進行標記，并對其熒光檢測進而實現(xiàn)免疫分析。時間分辨化學發(fā)光有著與電化學發(fā)光相似的敏感性，且更為穩(wěn)定。但儀器兼容性差，價格昂貴，操作相對繁瑣，對生產(chǎn)過程中試劑、水質(zhì)與環(huán)境要求較高。

2.全周期質(zhì)量控制要點

2.1 設(shè)計開發(fā)

①原材料的選擇是產(chǎn)品研發(fā)的基礎(chǔ)，發(fā)光免疫類體外診斷試劑的主要原材料為抗體、抗原、固相載體和標記物等。設(shè)計開發(fā)過程應充分考慮抗體/抗原濃度、純度、效價并進行功能性驗證。同時，固相載體（如微球）的磁性、發(fā)光強度、包被能力都直接影響產(chǎn)品的性能。②設(shè)計開發(fā)的關(guān)鍵是確定包被與標記等關(guān)鍵工藝，如抗體與微球交聯(lián)的方法和時間、滴配比例、適用機型的選擇等。企業(yè)應充分驗證上述關(guān)鍵工藝，同時輸出相應的技術(shù)文件。

表1. 發(fā)光免疫類體外診斷試劑的比較

2.2 環(huán)境控制

①生產(chǎn)環(huán)境：依照《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量規(guī)范附錄體外診斷試劑》，企業(yè)應于10萬級潔凈車間生產(chǎn)發(fā)光免疫類試劑。②工藝用水：工藝用水是發(fā)光免疫類診斷試劑的關(guān)鍵控制點，如時間分辨熒光對水質(zhì)有較高的要求。企業(yè)應定期對制水系統(tǒng)進行維護保養(yǎng)，清洗消毒，根據(jù)產(chǎn)品特點選擇《藥典》或YY/T1244標準對總出、總回以及使用點的水質(zhì)進行監(jiān)測。③倉儲：免疫發(fā)光試劑的原材料、中間品及成品的儲存條件多為冷藏（2～8°C）或冷凍（-20°C），因此其原材料庫、中間品庫、成品庫、留樣庫的溫濕度控制是保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。企業(yè)應配備溫濕度控制及報警系統(tǒng)并考慮產(chǎn)品運輸?shù)姆€(wěn)定性。

2.3 采購控制

①企業(yè)應根據(jù)設(shè)計輸出的采購要求進行原材料的采購，與關(guān)鍵原材料如抗體/抗原、微球的供方簽訂質(zhì)量協(xié)議，明確質(zhì)量要求和驗收標準。②原材料的進貨檢驗可采用自檢或查看供方質(zhì)保書，必要時進行功能性驗證，最終要符合原材料質(zhì)量要求和驗收標準。③原材料要留存采購記錄，如采購訂單、采購合同、隨貨同行單、入庫單、發(fā)票等，用以保證原材料的可追溯性。④為滿足發(fā)光免疫類試劑的準確性，企業(yè)需重點關(guān)注外購標準品、校準品、質(zhì)控品、生產(chǎn)或質(zhì)控用的血液是否滿足可追溯要求。

2.4 生產(chǎn)管理

①工藝：企業(yè)應重點關(guān)注其是否按照工藝規(guī)程進行生產(chǎn)；關(guān)鍵工序和特殊工藝（如交聯(lián)和標記工藝）是否經(jīng)過驗證；批生產(chǎn)記錄中是否記錄了關(guān)鍵工序和特殊過程的參數(shù)。②追溯：批生產(chǎn)記錄是否對生產(chǎn)批號、數(shù)量、關(guān)鍵原材料的批號等信息進行記錄并滿足追溯的要求。③除成品效期外，是否考慮了中間品、半成品（如交聯(lián)標或標記好的中間品）的儲存條件和儲存期限，并完成驗證。

2.5 質(zhì)量控制

①進貨檢驗：企業(yè)應根據(jù)物料質(zhì)量要求對關(guān)鍵物料實施進貨檢驗，必要時進行功能性驗證，并關(guān)注需冷藏冷凍運輸?shù)脑牧系倪\輸記錄。②過程檢驗：中間品、半成品檢驗應與批生產(chǎn)記錄關(guān)聯(lián)，滿足可追溯的要求。③成品檢驗：應建立批檢驗記錄，同時要涵蓋產(chǎn)品技術(shù)要求中的性能指標。④檢驗設(shè)備如免疫發(fā)光儀等應定期校驗，如企業(yè)有自校能力也可自行校準。⑤校準品、參考品的量值溯源是保證診斷試劑有效性的關(guān)鍵，企業(yè)應建立校準品、參考品量值溯源程序，并按照程序進行賦值。

3.現(xiàn)場核查常見問題匯總

以發(fā)光免疫類體外診斷試劑的控制要點為基礎(chǔ)，在經(jīng)過大量現(xiàn)場核查后，對核查過程中常見問題進行匯總。

3.1 設(shè)計開發(fā)方面

①企業(yè)設(shè)計和開發(fā)輸出不滿足輸入要求，如工藝配方中抗原/抗體等供應商與研發(fā)選擇不一致，作業(yè)指導中滴配方法，比例輸出不完整，檢驗規(guī)程不完善等。②當發(fā)生設(shè)計和開發(fā)變更時，未識別相應的更改，也未對設(shè)計和開發(fā)變更進行評審、驗證和確認，在變更前也未得到批準。

3.2 環(huán)境控制方面

①制水系統(tǒng)：制水系統(tǒng)無法滿足產(chǎn)品特性及生產(chǎn)需要，未按照企業(yè)規(guī)定進行定期監(jiān)測，凈化車間未區(qū)分純化水與自來水，工藝用水系統(tǒng)未按要求進行定期的再驗證。②空調(diào)系統(tǒng)：空調(diào)凈化系統(tǒng)未按規(guī)定進行定期的檢測以及維護保養(yǎng)。③倉儲：原材料、中間品及成品庫未設(shè)置溫濕度計、溫濕度記錄不完整或不滿足產(chǎn)品要求。

3.3 采購控制方面

①未對關(guān)鍵原料的供應商進行評價、未簽訂質(zhì)量協(xié)議、質(zhì)量協(xié)議中未明確雙方質(zhì)量責任和驗收標準。②原材料的進貨檢驗不滿足產(chǎn)品質(zhì)量要求。③生產(chǎn)批記錄中未記錄原材料批號或原材料無采購記錄導致無法追溯。④生產(chǎn)用或質(zhì)控用血液無法追溯。

3.4 生產(chǎn)管理方面

①未明確生產(chǎn)過程中需要進行清潔處理的如包材等的清潔方法和要求，且未對清潔效果進行驗證。②關(guān)鍵工序和特殊工藝未驗證或驗證不充分。③生產(chǎn)記錄內(nèi)容不完整，不滿足追溯要求（如未記錄關(guān)鍵原材料的批號信息等）。④未明確中間品和半成品的儲存條件和期限。

3.5 質(zhì)量控制方面

①成品出廠檢測不能完全涵蓋產(chǎn)品技術(shù)要求中的性能指標。②原材料、中間品、成品的檢驗記錄無法關(guān)聯(lián)，不滿足可追溯要求。③檢驗設(shè)備如化學發(fā)光儀等未能進行定期的校準。④放行程序文件中未明確具體的放行要求和放行人。⑤校準品、參考品未按照企業(yè)的量值溯源程序進行賦值，未建立校準品、參考品臺賬，未對每批生產(chǎn)的校準品、參考品進行賦值。

4.小結(jié)

隨著我國醫(yī)療健康事業(yè)的不斷發(fā)展，體外診斷技術(shù)也在迅猛前進，我國自主研發(fā)的體外診斷試劑層見疊出，已逐漸打破了體外診斷試劑主要依靠進口的市場格局。免疫診斷領(lǐng)域因其針對腫瘤標記物、內(nèi)分泌功能、激素、傳染病、心腦血管等常見疾病的診斷，占據(jù)了體外診斷市場中的重要份額。免疫診斷領(lǐng)域中最具代表的就是發(fā)光免疫技術(shù)，但該技術(shù)在我國起步較晚且多為封閉系統(tǒng)，因此發(fā)光免疫診斷試劑及其配套儀器依然以進口為主。不過隨著國家對醫(yī)療健康事業(yè)不斷加大投入的背景下，發(fā)光免疫診斷技術(shù)也實現(xiàn)了突破，目前正朝著成本低、靈敏度高、操作簡便等方面不斷探索。除研發(fā)能力外，如何提升企業(yè)的全周期管理能力也是目前亟須思考和突破的方面。對于發(fā)光免疫診斷技術(shù)來說應從法規(guī)要求的理解、人才培養(yǎng)，設(shè)施設(shè)備維護，生產(chǎn)質(zhì)控管理等多方面進行考量，進一步提升國產(chǎn)發(fā)光免疫診斷試劑的市場競爭力，力求從技術(shù)層面到生產(chǎn)質(zhì)量等全面趕超進口試劑，實現(xiàn)發(fā)光免疫診斷試劑及其配套設(shè)備的國產(chǎn)化。