賀 瑤,曹 健,何東平,2,鄭竟成,2
(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,武漢 430023; 2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室,武漢 430023)
微擬球藻,原屬于綠藻門,后被劃歸為真眼點藻綱,是一種分布廣泛的海水藻,也是公認(rèn)的最有希望用于工業(yè)化的高產(chǎn)油藻類。微擬球藻富含各種不飽和脂肪酸,其中二十碳五烯酸(EPA)含量可達(dá)總脂肪酸的30%左右,因此被稱為最有潛力的EPA研究藻種之一[1]。作為一種單細(xì)胞藻類,微擬球藻除了脂質(zhì)含量高,還具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、個體小、繁殖速度快等特點。因此,微擬球藻及其脂質(zhì)的開發(fā)與利用近年來受到廣泛的研究。
EPA屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸,可降低甘油三酯和膽固醇的含量,促進(jìn)飽和脂肪酸在體內(nèi)的代謝[1-4]。在現(xiàn)代人的日常飲食中,膽固醇和油脂的攝入量大幅上升,導(dǎo)致心血管疾病成為了主要的健康問題之一。而EPA已被證實對治療動脈粥樣硬化、高血壓和炎癥有效[4-5]。因此,研究開發(fā)富含EPA的產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價值。微藻中脂肪酸組成穩(wěn)定、培養(yǎng)繁殖簡單、生長周期短,因此微藻作為EPA等不飽和脂肪酸的來源之一具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>
亞臨界流體提取技術(shù)具有很多獨特的優(yōu)點,如提取效率高、提取壓力低、提取溫度低等,已被廣泛應(yīng)用于植物脂質(zhì)[6-7]和動物脂質(zhì)[8-10]的提取,但將該技術(shù)應(yīng)用于微擬球藻脂質(zhì)的提取鮮有報道。亞臨界流體提取技術(shù)應(yīng)用于微擬球藻脂質(zhì)的提取可以保護(hù)多不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì),最大程度地減少氧化的發(fā)生。本文以微擬球藻膨化料為原料,采用亞臨界流體丁烷提取技術(shù)對微擬球藻脂質(zhì)進(jìn)行提取,在單因素試驗的基礎(chǔ)上利用正交試驗對影響微擬球藻脂質(zhì)提取率的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳工藝條件,并檢測其基本物性指標(biāo),為微擬球藻脂質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
1.1.1 原料與試劑
微擬球藻膨化料,煙臺海融微藻養(yǎng)殖有限公司;脂肪酸、磷脂標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma公司;乙醇、硫代硫酸鈉、氫氧化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀等均為市售分析純。
1.1.2 儀器與設(shè)備
馬弗爐;1100高效液相色譜儀、8860氣相色譜儀,美國安捷倫科技公司;CBE-5L亞臨界丁烷提取裝置,河南亞臨界生物技術(shù)有限公司。
1.2.1 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)
稱取500 g微擬球藻膨化料,以丁烷為提取溶劑,在一定條件下進(jìn)行亞臨界動態(tài)提取,提取完畢后,減壓蒸發(fā),收集微擬球藻脂質(zhì),計算微擬球藻脂質(zhì)提取率[8]。每個樣品做3次平行試驗,取平均值。微擬球藻脂質(zhì)提取率按下式計算。
微擬球藻脂質(zhì)提取率=亞臨界提取脂質(zhì)提取量/索氏抽提脂質(zhì)提取量×100%
1.2.2 微擬球藻脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)分析
酸價,GB 5009.229—2016第二法;過氧化值,GB 5009.227—2016第二法;碘值,GB/T 5532—2008;脂肪和脂肪酸組成,GB 5009.168—2016第一法;磷脂含量,GB/T 5537—2008。
2.1.1 提取次數(shù)對提取率的影響
在提取溫度45℃、單次提取時間40 min、料液比1∶8的條件下,按提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6 次進(jìn)行亞臨界丁烷提取,考察提取次數(shù)對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響,結(jié)果見圖1。
圖1 提取次數(shù)對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響
由圖1可知,隨著提取次數(shù)的增加,提取率不斷增加。從第1次到第4次,提取率迅速增加,達(dá)到41.01%;從第4次增至第6次,提取率趨于平緩,繼續(xù)增加提取次數(shù)意義不大。為了適當(dāng)簡化操作的流程,減少能量的損耗,提高效率,將提取次數(shù)確定為4次。
2.1.2 單次提取時間對提取率的影響
在提取溫度45℃、料液比1∶8、提取4次的條件下,按單次提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行亞臨界丁烷提取,考察單次提取時間對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響,結(jié)果見圖2。
圖2 單次提取時間對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響
由圖2可知,隨著單次提取時間的延長,提取率逐漸上升。單次提取時間從10 min延長至40 min時,提取率增至41.13%。隨后單次提取時間逐漸延長至60 min,提取率增加變緩。10~20 min時提取剛開始,此時細(xì)胞內(nèi)部油脂還未向外部溶劑擴(kuò)散[11],因此提取率較低;隨著提取時間的延長,在20~40 min時細(xì)胞內(nèi)部油脂向外部溶劑擴(kuò)散,提取率快速升高,40 min時基本達(dá)到最高值;40 min 之后提取逐漸達(dá)到平穩(wěn)階段以及慢速傳質(zhì)階段,細(xì)胞內(nèi)部油脂向外部溶解擴(kuò)散達(dá)到動態(tài)平衡之后,提取率增加不明顯。綜上,選擇單次提取時間40 min為宜。
2.1.3 提取溫度對提取率的影響
在料液比1∶8、單次提取時間40 min、提取4次的條件下,按提取溫度分別為30、35、40、45、50、55℃進(jìn)行亞臨界丁烷提取,考察提取溫度對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響,結(jié)果見圖3。
圖3 提取溫度對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響
由圖3可知:當(dāng)提取溫度在45℃以下時,隨著提取溫度的升高,微擬球藻脂質(zhì)提取率隨之增加,當(dāng)提取溫度達(dá)到45℃時,提取率達(dá)到最大;但提取溫度超過45℃后,隨著丁烷分子運(yùn)動加速導(dǎo)致其密度有所降低,汽化程度增加,與物料接觸面積減少,使提取速率逐漸下降[12]。此外,提取溫度升高還會加速脂質(zhì)中不飽和脂肪酸的分解,故最佳提取溫度選擇45℃。
2.1.4 料液比對提取率的影響
在提取溫度45℃、單次提取時間40 min、提取4次的條件下,按料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12進(jìn)行亞臨界丁烷提取,考察料液比對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響,結(jié)果見圖4。
圖4 料液比對微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響
由圖4可知,隨著料液比的增加,提取率逐漸升高,但在料液比超過1∶8后,提取率增加不明顯,說明此時微擬球藻中的脂溶性成分幾乎提取完全,因此提取率基本穩(wěn)定,上升緩慢。若繼續(xù)增加丁烷的用量,會降低總體提取效率,也會增加能耗。綜合考慮,選擇料液比1∶8。
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以提取率為評價指標(biāo),采用四因素三水平正交試驗表L9(34),優(yōu)化亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)的工藝條件。選取提取次數(shù)、單次提取時間、提取溫度、料液比作為優(yōu)化因素,正交試驗因素水平見表1,正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。
表1 正交試驗因素水平
表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果
由表2可知,各因素對微擬球藻脂質(zhì)提取率影響的主次排序為A>B>C>D,即提取次數(shù)>單次提取時間>提取溫度>料液比。工藝參數(shù)最佳組合為A2B2C2D2,即提取次數(shù)4次,單次提取時間40 min,提取溫度45℃,料液比1∶8。
取同一批次微擬球藻膨化料3份,每份500 g,在提取次數(shù)4次、單次提取時間40 min、提取溫度45℃、料液比1∶8的條件下進(jìn)行3組平行試驗,微擬球藻脂質(zhì)的平均提取率為41.55%,說明工藝穩(wěn)定可行。在最佳條件下提取的微擬球藻脂質(zhì)呈深綠色油性糊狀,其酸價(KOH)20.4 mg/g,過氧化值0.001 g/100 g,碘值(I)86.0 g/100 g,磷脂含量107.28 mg/g。
與其他油脂提取相比,微擬球藻脂質(zhì)提取率整體偏低,可能是因為雖然經(jīng)過了膨化處理,但是微擬球藻的破壁率并不高,導(dǎo)致了在提取過程中,有機(jī)溶劑不能很好地滲透到微藻細(xì)胞內(nèi),從而造成整體提取率偏低。
亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質(zhì)中含有豐富的脂肪,通過內(nèi)標(biāo)法對脂肪的組成和含量進(jìn)行了分析,結(jié)果見表3。
表3 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)中脂肪組成及含量
由表3可知,亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)總脂肪含量40.22%,其中飽和脂肪含量14.51%,不飽和脂肪含量25.71%。ω-3脂肪含量7.24%,ω-6脂肪含量3.30%,ω-9脂肪含量4.39%。對亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質(zhì)成分進(jìn)行進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)其中還含有甘露醇、葉綠素、類胡蘿卜素、植物甾醇等其他成分。
為進(jìn)一步了解微擬球藻脂質(zhì)的脂肪酸組成,利用GC對微擬球藻脂質(zhì)中的脂肪酸組成進(jìn)行了檢測,結(jié)果見表4。
表4 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)中主要脂肪酸組成及含量
由表4可知,微擬球藻脂質(zhì)中脂肪酸主要以不飽和脂肪酸為主,其中EPA含量為7.21%。本次測定的微擬球藻脂質(zhì)中的EPA含量,相較于一些報道[13]偏低,推測與藻粉批次和藻粉的膨化工藝有關(guān),但不影響對亞臨界丁烷提取工藝的研究。
通過單因素試驗和正交試驗確定了亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)的最佳工藝條件為:提取次數(shù)4次,單次提取時間40 min,提取溫度45℃,料液比1∶8。在最佳工藝條件下,微擬球藻脂質(zhì)提取率為41.55%。提取的微擬球藻脂質(zhì)呈深綠色油性糊狀,其酸價(KOH)20.4 mg/g,碘值(I)86.0 g/100 g,過氧化值0.001 g/100 g,磷脂含量107.28 mg/g。亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質(zhì)中總脂肪含量為40.22%,不飽和脂肪酸含量較高,其中EPA含量為7.21%。