郭 旋 李華泳 張 寧 曾 香 劉德清 馬青蘭 王艷午 蔣振南 馮建遠(yuǎn)

（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)金光有限公司，廣西南寧 530042）

豬鏈球菌是引起豬鏈球菌病的最主要病原，主要引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、肺實(shí)質(zhì)性病變和敗血癥等癥狀。與疾病最為相關(guān)的是豬鏈球菌2型，1991年我國廣東省首次報(bào)告該病的發(fā)生[1]。豬鏈球菌是豬場常在菌，發(fā)病率較高，當(dāng)飼養(yǎng)管理不善時(shí)更易發(fā)病，容易與其他疾病發(fā)生混合感染或作為藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病等免疫抑制性疾病的繼發(fā)病，給豬只的健康生長帶來威脅[2,3]。因此,開展細(xì)菌性疾病的快速分離鑒定，通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，減少藥物濫用，精準(zhǔn)用藥并通過生物安全防控和良好的生產(chǎn)管理可有效降低細(xì)菌性疾病發(fā)生，降低死淘率，并達(dá)到“減抗”的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2019年11月，廣西南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)某豬場20kg左右的保育豬，零星出現(xiàn)體溫升高至40.5～41.5℃，突然倒地，四肢做游泳狀劃動(dòng)。病弱豬隔離欄有7頭出現(xiàn)后肢關(guān)節(jié)腫大、腳痛癥狀。對其中2頭倒地豬進(jìn)行解剖，無菌采集病豬腦、肺臟、淋巴結(jié)。將2頭后肢關(guān)節(jié)腫大的豬，用一次性無菌注射器無菌采集腫大處的關(guān)節(jié)液。樣品采集后置于含冰塊的泡沫箱中2 h內(nèi)，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.1.2 試劑

2×TapMix購自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；藥敏紙片購自溫州市康泰生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒、哥倫比亞血平板、TSB培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列參考GB/T 19915.4-2000，適用于由豬鏈球菌2型致病基因和致病菌株的檢測。見表1。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌采集腦和關(guān)節(jié)液接種于哥倫比亞血平板，培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取具有溶血環(huán)的疑似豬鏈球菌小菌落，接種到 1 個(gè)新的哥倫比亞血平板中培養(yǎng) 24 h，同時(shí)接種到含 5%血清的 TSB 培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng) 24 h。

表1 鏈球菌PCR擴(kuò)增引物

1.2.2 觸酶反應(yīng)

用滅菌接種環(huán)將純培養(yǎng)的疑似豬鏈球菌小菌落挑入1 mL 滅菌生理鹽水中，振蕩，制成懸液，然后加入1 mL 3%過氧化氫溶液，同時(shí)用金黃色葡萄球菌的鹽水菌懸液做陽性對照，觀察是否出現(xiàn)氣泡。

1.2.3 細(xì)菌的染色鏡檢

挑取疑似豬鏈球菌的純培養(yǎng)菌落涂布于載玻片中，采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色后置于顯微鏡高倍鏡下鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.4 PCR 鑒定

參考 GB/T 19915.4-2000 進(jìn)行 PCR 檢測。取 200 μL TSB 中的增菌培養(yǎng)液，12 000 r/min 離心 5 min，棄去培養(yǎng)基，用無菌雙蒸水洗滌沉淀 2 次，并用 100 μL超純水重懸細(xì)胞。采用煮沸裂解法制備細(xì)菌 DNA 模板，即將重懸菌液煮沸 10 min，瞬時(shí)置于冰浴中冷卻 5 min，12 000 r/min 離心 5 min，取上清液作為 DNA 模板。PCR 反應(yīng)體系為：2×TapMix 12.5 μL、6 條引物各 0.5 μL，cDNA 樣品 3 μL，補(bǔ) ddH2O 至 25 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃延伸 40 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 4 min，4℃保存。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。

1.2.5 K-B 藥敏試驗(yàn)

用滅菌棉簽刮取純培養(yǎng)的菌落溶解于滅菌生理鹽水中，制備成 0.5 麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。用無菌棉拭子蘸取菌懸液均勻涂布于 MH 瓊脂平板上，放置 3～5 min干燥后貼上藥敏紙片，于 37℃培養(yǎng) 24 h 后，測量抑菌環(huán)直徑[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

在其中1頭豬的腦中分離到1株疑似菌株。在哥倫比亞血平板中的疑似菌落呈細(xì)小、圓形凸起的灰白色菌落，菌落周邊呈β溶血。

2.2 觸酶反應(yīng)結(jié)果

金黃色葡萄球菌的鹽水菌懸液與3%過氧化氫溶液反應(yīng)出現(xiàn)大量氣泡，陽性對照成立。純培養(yǎng)的疑似豬鏈球菌鹽水菌懸液與3%過氧化氫溶液反應(yīng)無氣泡出現(xiàn)，觸媒反應(yīng)陰性。

2.3 細(xì)菌的染色鏡檢結(jié)果

在顯微鏡油鏡下觀察，哥倫比亞血平板上純培養(yǎng)的菌落被革蘭氏染液染成紫色，為球狀，呈單個(gè)、成對或短鏈排列，見圖1。在含5%血清的TSB培養(yǎng)物被革蘭氏染液染成紫紅色，為球狀，多數(shù)呈長鏈狀排列，見圖2。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示被測樣品在250 bp～500 bp之間的387 bp處出現(xiàn)目的條帶，可判定為豬鏈球菌2型。見圖3所示。

2.5 K-B藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選擇養(yǎng)殖場常用的14種藥物的藥敏紙片做藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2。分離菌對多西環(huán)素、氧氟沙星、萬古霉素、恩諾沙星高度敏感；對青霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氟苯尼考敏感；對氨芐西林、阿莫西林、卡那霉素、桿菌肽和慶大霉素耐藥。

3 討論

對豬場細(xì)菌性疾病進(jìn)行快速鑒別診斷，并開展藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，是快速治療細(xì)菌性疾病，減少發(fā)病率和病死率的重要方法。本試驗(yàn)結(jié)合豬場背景、發(fā)病豬的臨床癥狀和病理解剖變化，初步懷疑為豬鏈球菌感染。通過從病豬腦部分離培養(yǎng)細(xì)菌，采用染色液鏡檢、觸媒試驗(yàn)和PCR鑒別診斷，確定為豬鏈球菌2型感染。然后開展藥敏試驗(yàn)，篩選敏感藥物。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由于國家“減抗”“禁抗”措施的推進(jìn)，鏈球菌等細(xì)菌性疾病的防控不能再繼續(xù)依靠使用大量抗生素進(jìn)行普防或治療，而應(yīng)該逐漸通過加強(qiáng)生物安全綜合防控、疫苗免疫等措施[5]。同時(shí)，自2018年8月我國首次發(fā)生非洲豬瘟疫情以來，養(yǎng)豬業(yè)遭受了巨大損失，生物安全防控被證實(shí)為目前最有效的非洲豬瘟防控方法，短時(shí)間內(nèi)推動(dòng)了我國養(yǎng)豬場生物安全體系的跨越式提升，也將有利于對其他疫病的防控。本試驗(yàn)分離到的豬鏈球菌來源的豬場，有使用阿莫西林給保育豬飲水保健，以防治轉(zhuǎn)群后應(yīng)激產(chǎn)生細(xì)菌性疾病的習(xí)慣，可能是導(dǎo)致本次藥敏試驗(yàn)中阿莫西林耐藥的原因之一。因此，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選敏感藥物，減少藥物保健和阿莫西林使用頻次，精準(zhǔn)用藥并逐漸減少抗生素用量，通過生物安全防控和良好的生產(chǎn)管理來達(dá)到減少疾病發(fā)生和達(dá)到“減抗”的目標(biāo)。

11月份南方天氣開始轉(zhuǎn)涼，晝夜溫差大，部分豬場為了減少溫差會(huì)在夜間下卷簾或是減少通風(fēng)來給豬舍保溫，從而也導(dǎo)致了豬舍空氣混濁，氨氣刺激等造成豬只抵抗力下降，容易誘發(fā)細(xì)菌性疾病。本研究的樣品來源豬場保育豬出現(xiàn)咳嗽，部分豬只出現(xiàn)腳痛和突然倒地伴隨發(fā)燒等癥狀，前期對病豬肌注頭孢噻呋鈉和安痛定，沒能有效治愈病豬。因而對病豬進(jìn)行解剖并采樣送實(shí)驗(yàn)室檢測。在1頭發(fā)生神經(jīng)癥狀的保育豬腦中分離培養(yǎng)到1株鏈球菌，經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌2型。參考藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對神經(jīng)倒地豬只注射磺胺嘧啶鈉和地塞米松，喘氣并發(fā)燒的豬只注射氟苯尼考和VC，隔離欄病弱豬在飲水中添加多西環(huán)素。7天后病豬康復(fù)，并沒有新增病例。同時(shí)對其他未發(fā)病的豬舍通過調(diào)節(jié)通風(fēng)與保溫相平衡來保持欄舍環(huán)境適宜、干燥清潔，及時(shí)隔離好打斗豬只，減少豬只外傷和應(yīng)激，減少豬鏈球菌病的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究對發(fā)生倒地、有神經(jīng)癥狀的保育豬進(jìn)行解剖，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色液鏡檢、觸媒試驗(yàn)和PCR鑒別診斷，分離到1株2型豬鏈球菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選了敏感藥物，結(jié)合豬場情況進(jìn)行敏感藥物治療和強(qiáng)化生產(chǎn)管理、生物安全防控措施，有效治愈病豬并降低了發(fā)病率，可為其他養(yǎng)豬場秋季防治細(xì)菌性疾病提供參考。