莫云鋒

（廣西岑溪市馬路鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站 543202）

豬偽狂犬病毒是皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘-帶狀病毒屬的成員[1]，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的最為重要傳染病之一，具有流行廣泛、傳播迅速、發(fā)病率與致死率高等特征[2]。早在1813年就有此病的報(bào)道，1910年Schmiedhoffer首次分離到該病毒。在我國(guó)，1947年劉永純首次分離出PRV，1956年周圣文等人在哺乳豬中發(fā)現(xiàn)該病，自1979年確定為豬偽狂犬病以來(lái)，世界多個(gè)國(guó)家都有此病的爆發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬偽狂犬病侵害不同年齡段的豬群，對(duì)2周齡內(nèi)的仔豬危害最為嚴(yán)重，可達(dá)到100%。主要以高熱、呼吸困難、震顫等癥狀為特征，成年豬以呼吸道癥狀為主，康復(fù)后的成年豬通常生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成的經(jīng)濟(jì)損失日趨嚴(yán)重[3]。

豬大腸桿菌病是一種革蘭氏陰性短桿菌，是動(dòng)物體內(nèi)重要的腸道菌群，屬于條件性致病菌，大多不致病，但某些血清型菌株的致病性較強(qiáng)，可引起腹瀉，稱為致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌是一種重要的人獸共患病原菌，其血清型較多，給防控帶來(lái)一定的難度。豬大腸桿菌病是一種急性傳染病，由致病性大腸桿菌引起，主要以腹瀉為主[4]。豬感染大腸桿菌后發(fā)生腹瀉，繼而導(dǎo)致機(jī)體脫水，敗血癥或繼發(fā)其他疫病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重影響。

1 材料

1.1 主要試劑和儀器

病毒DNA/RNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DL 2000 DNA Marker均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；血平板培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Bio-rad公司。

1.2 樣品來(lái)源

2019年10月廣西某豬場(chǎng)育肥豬的脾臟、肺臟、腦、淋巴結(jié)等病料樣品。PRV陽(yáng)性疫苗保存于岑溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室。

2 診斷方法

2.1 臨床癥狀及剖檢變化

病豬出現(xiàn)精神不振，體溫升高，呼吸急促，腹瀉。對(duì)病死豬剖檢可見(jiàn)，腹股溝淋巴結(jié)水腫，肝臟有白色壞死點(diǎn)，肺臟水腫，脾臟腫大，小腸系膜和胃漿膜有點(diǎn)狀出血，胃底黏膜潰瘍，胃腸黏膜呈現(xiàn)卡他性、出血性炎癥變化。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查

用接種環(huán)取淋巴結(jié)、脾臟和肺臟樣品，采用平板劃線法，接種在血瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)18～24h后觀察，并進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片法[5]，選用青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等10類(lèi)共14種常用抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。

2.4 病原檢測(cè)

2.4.1 病料DNA的提取

無(wú)菌剪取病死豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料樣品放入研磨器中混均研磨，加入適量的滅菌生理鹽水，-70℃反復(fù)凍融3次，8000r/min離心5min，取上清液，按病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行組織樣品DNA的提取。提取的病毒核酸-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 引物設(shè)計(jì)

擴(kuò)增偽狂犬病毒gD基因中的基因片段，上游引物為PRVF（5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'）和下游引物為PRV-R（5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'）， 擴(kuò)增長(zhǎng)度 217bp。 引物由廣州華大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR檢測(cè)方法

PRV的反應(yīng)體系為：2×Es Taq MasterMix 13μL，DNA模板3μL， 上游引物、 下游引物各 1μL， ddH2O 7μL， 總體系共25μL。瞬時(shí)離心混勻，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 1 min，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10min，12℃保存。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的鑒定

在血瓊脂培養(yǎng)基平板上，淋巴結(jié)和脾臟均分離到細(xì)菌。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢可觀察到革蘭氏陰性桿菌。將單個(gè)菌落接種在麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，結(jié)果細(xì)菌均生長(zhǎng)出大腸桿菌特有的粉紅色。進(jìn)行生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此病原菌可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，MR試驗(yàn)陽(yáng)性。VP試驗(yàn)陰性，動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，不利用枸櫞酸鹽，也不產(chǎn)生H2S氣體。經(jīng)過(guò)以上鑒定可以確定該分離菌為大腸桿菌。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知 （附表），分離的大腸桿菌對(duì)頭孢噻肟高度敏感，對(duì)阿米卡星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等中度敏感，對(duì)頭孢拉定、慶大霉素、壯觀霉素、羅紅霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、阿莫西林、氨芐西林、克林霉素、林可霉素耐藥。

3.3 PCR結(jié)果

通過(guò)PCR方法對(duì)病料樣品和陽(yáng)性樣品分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果病料樣品和陽(yáng)性樣品的片段大小均在217bp，表明該病料中PRV為陽(yáng)性 （附圖）。

4 預(yù)防及治療

可采取以下措施預(yù)防該病的發(fā)生：及時(shí)隔離并治療發(fā)病豬，對(duì)病死豬采取無(wú)害化處理，防止病毒和細(xì)菌大量繁殖擴(kuò)散，對(duì)已經(jīng)污染的圈舍、飼具和場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格消毒。對(duì)病豬采用肌肉注射頭孢噻呋、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)移因子等。對(duì)保育豬群進(jìn)行肌注偽狂犬病毒疫苗，對(duì)哺乳仔豬用偽狂犬病毒疫苗滴鼻，豬群飼料中添加黃芪多糖、恩諾沙星，在飲水中添加多維。

5 討論

當(dāng)前，由于母豬大量使用疫苗，導(dǎo)致偽狂犬病發(fā)生于育肥豬的現(xiàn)象比較常見(jiàn)，偽狂犬的凈化問(wèn)題仍然是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)較為嚴(yán)重的問(wèn)題之一[6]，因此，通過(guò)全群檢測(cè)加淘汰野毒陽(yáng)性豬的方法可以快速凈化豬場(chǎng)。我國(guó)研究學(xué)者也加強(qiáng)了對(duì)不同地區(qū)豬偽狂犬病流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)，山東省豬偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性感染率高達(dá)61.74%，福建省龍巖地區(qū)豬偽狂犬病野毒抗體的陽(yáng)性感染率達(dá)30.41%，江蘇地區(qū)豬偽狂犬病野毒抗體的陽(yáng)性感染率達(dá)36%[7-9]。以上的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)不同地區(qū)豬群中均存在一定的豬偽狂犬病流行，豬偽狂犬病感染情況比較普遍，不同地區(qū)感染率差異也較大，需要加強(qiáng)其控制和凈化措施，制定科學(xué)合理的免疫程序，并加強(qiáng)該病綜合防控十分必要。

目前臨床上沒(méi)有有效的疫苗來(lái)預(yù)防大腸桿菌病，采用抗菌藥物防治仍是主要措施[10]。由于大腸桿菌易形成耐藥性，特別是濫用抗菌藥物，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，抗菌藥物常作為飼料添加劑用來(lái)預(yù)防和促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)，這些都導(dǎo)致了大腸桿菌耐藥菌株的產(chǎn)生。因此，病豬治療前應(yīng)先對(duì)分離病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感性抗生素用于治療。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生的控制，及時(shí)清掃圈舍，保持豬舍衛(wèi)生、干燥，使用適宜消毒液進(jìn)行消毒，最好采取全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式。