劉喜雨 曹榮昌 陳富珍 黃建新

（大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 671003）

紫錐菊 (Echinacea)，又稱(chēng) “金花菊”，屬于菊科，是一種多年生植物，起源于北美東部，且在北美洲作為藥用植物已有上百年的歷史，最早用于治療感冒及上呼吸道感染［1，2］。近幾年，紫錐菊多糖 （Echinacea purpurea Polysaccharide，EPS）的應(yīng)用已逐漸從臨床治療向動(dòng)物生產(chǎn)方向轉(zhuǎn)移，且大量體內(nèi)與體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，紫錐菊多糖主要通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力發(fā)揮抗炎、抗細(xì)菌和抗病毒等方面的功效。而近幾年紫錐菊多糖已作為一種飼料添加劑應(yīng)用在畜禽生產(chǎn)中[3]。

黃芪多糖 （Astragalus polysaccharin，APS）是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血糖、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等廣泛的生物學(xué)功能[4，5]，將其作為飼料添加劑或疫病預(yù)防治療藥物能增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞生理代謝、提高細(xì)胞免疫應(yīng)答水平、抑制或消滅病原微生物的繁殖、提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和免疫功能[6]。

紫錐菊與黃芪多糖提取物均具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的作用。目前對(duì)于二者應(yīng)用的研究很多，但就其不同劑量組合應(yīng)用對(duì)小鼠免疫功能的影響研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)將二者按不同劑量組合配伍，探討其對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠免疫力低下時(shí)的影響，為后續(xù)研究提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2018年10月30日申購(gòu)65只4～6周齡雌性清潔級(jí)ICR小鼠，11月8日小鼠到貨，共65只，均重約15g/只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼喂適應(yīng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑

（1）藥品：紫錐菊顆粒， （規(guī)格：1g相當(dāng)于原生藥1.25g），購(gòu)自山東齊魯動(dòng)物保健品公司；黃芪多糖粉 （芪黃素）， （生產(chǎn)批號(hào)：1709201，規(guī)格：1g相當(dāng)于原生藥1.25g），購(gòu)自愛(ài)迪森 （北京）生物科技有限公司；環(huán)磷酰胺， （批號(hào)：13051025；有效期：2019.05.03，規(guī)格：0.2g/瓶），購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

（2）試劑：氯化鈉 （10019318）、氯化鉀 （10016318）、磷酸二氫鉀 （XK13～201）、磷酸氫鈉 （10020318）、葡萄糖（10007118），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及給藥程序

選取60只雌性清潔級(jí)ICR小鼠稱(chēng)重，隨機(jī)分成10組，按體重分為 19～20g， 20～21g， 21～22g， 22～23g， 23～24g， 24～25g，25～26g排列，然后按照S型取樣，每組6只，各組小鼠平均體重差異不超過(guò)1g。對(duì)10組進(jìn)行標(biāo)記，空白對(duì)照組腹腔注射0.2ml/d PBS緩沖液，其他各組腹腔注射0.2ml 80mg/(kg·d)CTX供試液，連續(xù)給藥3d。而后，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組連續(xù)5d灌胃等體積PBS緩沖液，其余8組小鼠連續(xù)5d分別灌胃高、中劑量的EPS、APS和EPS+APS不同劑量組合。小鼠分組及處理方式見(jiàn)表1。

1.2.2 供試液的制備

（1）CTX母液的制備

取一個(gè)1.5ml離心管 （采用小容量管稱(chēng)取是為了減少誤差）稱(chēng)取CTX原粉0.12520g，在無(wú)菌室加入PBS緩沖液反復(fù)稀釋轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，超聲溶解均勻，用5ml注射器吸取5ml，去掉針頭，套上過(guò)濾頭 (以0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾)，將藥液注入50ml管中，同樣方法把剩下5ml也過(guò)濾加入50ml管中；再加入PBS緩沖液15ml，定量至25ml.制成5mg/mlCTX藥物母液。如表2所示。

表1 小鼠分組、給藥劑量及處理方式

（2）CTX供試液的制備

取1根50ml離心管按下表先加入藥物母液，再加PBS順序，渦旋混勻，制備供試液28ml。如表3所示。

（3）藥物供試液的制備

先配制好母液，再取10根10ml離心管，做好標(biāo)記。按下表先統(tǒng)一加入藥物母液，再加PBS順序，渦旋混勻，制備供試液20ml。按照給藥方案灌胃給藥，每天1次，連用5d。如表4所示。

1.3 相關(guān)測(cè)定

末次灌胃后24h，取股動(dòng)脈血分離血清，取脾臟制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.1 血清中細(xì)胞因子含量測(cè)定

股動(dòng)脈采血分離小鼠血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用ELISA法測(cè)定小鼠血清IL-2和TNF-α水平。

1.3.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

表2 CTX母液的制備

表3 CTX供試液的制備

斷頸處死小鼠，無(wú)菌條件下取小鼠的脾臟，加適量Hank's液研磨，綢布濾過(guò)，1500r/min離心5min，棄上清。渦旋細(xì)胞沉淀，加Hank's液重復(fù)洗滌2次。收集脾細(xì)胞，加適量RPMI 1640完全培養(yǎng)液混懸，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)不少于95%，加RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋?zhuān)⒄{(diào)整至所需的細(xì)胞濃度 （實(shí)際為細(xì)胞懸液倍比稀釋?zhuān)笜?biāo)儀測(cè)OD值，制備細(xì)胞數(shù)～OD值標(biāo)曲進(jìn)行計(jì)數(shù)）。于96孔微量板中，每孔加脾細(xì)胞懸液（7.5×106個(gè)/ml） 100μL， 每個(gè)脾細(xì)胞樣品重復(fù) 12孔， 分別加Con A液 （終濃度為 5μg/ml）、 LPS液 （終濃度為 10μg/ml） 或RPMI 1640培養(yǎng)液至總體積為200μL，重復(fù)3孔。另設(shè)培養(yǎng)液空白對(duì)照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)44h，各孔加MTT溶液 （2mg/ml）50μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。1800r/min離心 5min，棄去各孔上清，分別加DMSO溶液150μL，于室溫暗處以微量振蕩儀振蕩15min，以酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定OD值，計(jì)算刺激指數(shù)（SI值）。

刺激指數(shù) (Stimulatory index，SI)=加有絲分裂原培養(yǎng)物的OD值不加有絲分裂原培養(yǎng)物的OD值

1.3.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定

取指數(shù)生長(zhǎng)期的人紅白血病K562細(xì)胞或小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105cell/ml，作為靶細(xì)胞；取制備的1×107cell/ml的脾細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入效應(yīng)細(xì)胞懸液100μL(1×106cell)，重復(fù)8孔。其中4個(gè)復(fù)孔每孔加入靶細(xì)胞懸液 100μL(3×104cell)作為實(shí)驗(yàn)孔 （效靶比 50：1）， 另外 4個(gè)復(fù)孔每孔加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液100μL作為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照。再設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照組 （每孔加入靶細(xì)胞懸液100μL和RPIM-1640完全培養(yǎng)液100μL）和空白對(duì)照組 （即每孔加入RPIM 1640完全培養(yǎng)液200μL）。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1h。每孔加入 MTT溶液 （2mg/ml）50μL，繼續(xù)孵育 4h。1500rpm離心5min，棄去上清液，加入DMSO 150μL/well，于室溫暗處以微量振蕩儀振蕩15min，以酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.3.4 脾細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量測(cè)定 （ELISA）

于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取制備的脾細(xì)胞懸液，每孔加7.5×106cell/ml的脾細(xì)胞懸液1ml和刺激原稀釋液 (ConA終濃度為4μg/ml)各1ml，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，2500rpm離心5min，收集細(xì)胞上清。根據(jù)小鼠細(xì)胞因子 （INF-γ、IL-10）ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞因子含量。

1.3.5 血清免疫球蛋白測(cè)定

按試劑盒提供的ELISA法測(cè)定血清IgG、IgM和IgA水平，向酶標(biāo)板內(nèi)加入陰性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品或經(jīng)稀釋的待測(cè)血清樣品100μL，做復(fù)孔。酶標(biāo)板加上覆膜，水平放置，室溫孵育60min。棄去液體，甩干，用洗滌液洗滌4次，甩干。每孔加酶標(biāo)抗體100μL，加上覆膜，室溫避光孵育30min。棄去液體，甩干，用洗滌液洗滌4次，甩干。每孔加TMB底物溶液100μL，室溫避光孵育10min。依序每孔加終止溶液100μL，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值 (OD值)。

表5 小鼠平均體重指數(shù)

2 結(jié)果

2.1 體重指數(shù)

CTX造模3d后造模小鼠均出現(xiàn)體重明顯下降，造模成功；連續(xù)5d灌胃不同劑量組合藥液后得到，體重快速恢復(fù)增加的前3組分別是CTX陽(yáng)性對(duì)照組、PBS空白組和EPS（中劑量1.25）與APS（高劑量3.75）組；體重恢復(fù)慢的后3組分別是EPS（高劑量2.5）與APS（高劑量3.75）組、EPS（中劑量1.75）組、APS（中劑量1.875）組。說(shuō)明紫錐菊多糖與黃芪多糖不同劑量組合并沒(méi)有明顯增強(qiáng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。每組平均體重指數(shù)變化如表5所示。

2.2 脾臟指數(shù)

通過(guò)對(duì)脾臟進(jìn)行脾細(xì)胞增殖的相關(guān)試驗(yàn)，得出脾臟指數(shù)如表6所示。

表6 每組小鼠脾臟指數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.3 IgG、IgM含量測(cè)定結(jié)果

由圖1、2可知，通過(guò)收集小鼠血清檢測(cè)，模型組小鼠血清IgG、IgM抗體水平明顯低于空白對(duì)照組，造模成功，但給藥后效果不顯著。

3 討論

免疫增強(qiáng)劑是一類(lèi)通過(guò)非特異途徑提高機(jī)體對(duì)抗原的特異性反應(yīng)的物質(zhì)。有利于增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，緩解環(huán)境應(yīng)激造成的免疫功能紊亂或下降，使人或動(dòng)物健康生長(zhǎng)。紫錐菊和黃芪現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的免疫增強(qiáng)類(lèi)天然藥物之一，普遍應(yīng)用于臨床治療增強(qiáng)人或動(dòng)物的免疫機(jī)能。

許多研究表明，紫錐菊富含揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖等多種活性成分，具有改善機(jī)體免疫功能，降低動(dòng)物的發(fā)病率，從而提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[6]。姚維平等[7]報(bào)道在斷奶仔豬日糧中添加0.5%、1.0%、1.5%的紫錐菊復(fù)方可以顯著改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能一致。梁華平等 （1994）[8]測(cè)定發(fā)現(xiàn)，燒傷后6d小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，腹腔注射250mg/kg體重黃芪多糖，每天1次，連續(xù)5d，不僅可以明顯提高正常小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，還可使燒傷小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)恢復(fù)正常。倪耀娣等[9]發(fā)現(xiàn)，紫錐可提高肉雞對(duì)IBD疫苗的免疫力，并能顯著改善和提高肉雞的生產(chǎn)性能。其中最佳添加劑量為0.5%紫錐菊提取物單劑。在和黃芪配伍后，合劑 (0.5%+0.25%)、合劑 (1%+0.5%)劑量的免疫促進(jìn)效果與0.5%紫錐菊提取物單劑一致。所以本次試驗(yàn)導(dǎo)致小鼠體重恢復(fù)較慢的原因可能是藥物配伍劑量不足。

黃芪多糖能明顯增加小鼠脾臟、胸腺重量，同時(shí)能對(duì)抗免疫抑制劑潑尼松龍或強(qiáng)的松龍所造成的對(duì)脾、胸腺、腸淋巴結(jié)等免疫器官的萎縮作用，也能對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的脾臟萎縮。毛曉峰等[10]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能提高免疫應(yīng)激后斷奶仔豬的細(xì)胞免疫功能，降低炎性因子和應(yīng)激激素的分泌，從而發(fā)揮抗免疫應(yīng)激作用。張艷等[11]研究結(jié)果提示，APS對(duì)燒傷小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于巨噬細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)其分泌白細(xì)胞介素-1（IL-1），抑制前列腺素E2（PGE）合成，而促進(jìn)IL-2產(chǎn)生及IL-2受體 （IL-2R）2表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖。邱培勇等[12]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能有明顯抑制作用，黃芪多糖不僅能有效抑制抗免疫，對(duì)正常小鼠也有免疫增強(qiáng)作用。顏培宇等[13]發(fā)現(xiàn)，APS能重建免疫功能低下小鼠機(jī)體正常的免疫功能，促進(jìn)機(jī)體ThO向Thl的分化，維持Thl的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能。王曉珊[14]報(bào)道了在雞飼料中添加1.0%紫黃散能明顯提高雞的生長(zhǎng)性能與免疫功能。不同畜禽因生理機(jī)能不同，藥物劑量組合不同，通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)出適合于各種畜禽標(biāo)準(zhǔn)的劑量組合，更好地服務(wù)于畜禽生產(chǎn)，是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)課題。

4 結(jié)論

紫錐菊多糖與黃芪多糖均具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫的作用。而本次試驗(yàn)效果對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、IgG、IgM與脾細(xì)胞增殖都不明顯，可能是因?yàn)椴煌湮榻o藥療程太短、劑量組合不理想及操作失誤等原因，沒(méi)能明顯體現(xiàn)出紫錐菊多糖與黃芪多糖配伍對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。所以本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步完善，希望試驗(yàn)結(jié)果能對(duì)研究人員在進(jìn)行深入研究時(shí)有所幫助。