張若楠 于 雷 王 釗 韓榮偉 于忠娜*

（①青島農業(yè)大學海都學院 山東 萊陽 265200 ②青島農業(yè)大學食品科學與工程學院 山東 青島）

多重熒光定量PCR技術可以利用一次反應，同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的診斷上具有獨特優(yōu)勢和很高的實用價值。與實時熒光定量PCR技術結合，可以定量拷貝數、省去PCR后處理，減少交叉污染，整個檢測過程耗時短、準確、高效、特異。因此本文對多重熒光定量PCR技術的分類及各種方法的優(yōu)缺點做了簡要概述，并對近年來多重熒光定量PCR在動物中的應用概況及其研究進展，如在動物性食品衛(wèi)生中的應用、細菌病診斷、病毒病診斷、飼料中動物源性成分的檢測、抗性基因檢測及腫瘤早期診斷等有關方面進行概述，旨在為該技術的進一步開發(fā)應用提供理論參考。多重PCR技術與實時熒光定量PCR的結合，拓寬了其應用范圍，但也存在一定的局限性，如熒光基因種類有限、需要專門的儀器設備、外源DNA的干擾、引物探針含量及其特異性都可能影響檢測結果。因此，處理好這些問題是多重實時熒光定量PCR技術更好應用于動物研究中的關鍵。

自從20世紀80年代聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)[1]問世以來，該技術就成為體外快速擴增特定基因或DNA序列最常用的方法。但由于該方法是應用PCR來對樣品中的模板量進行定量，也就是說需要通過凝膠電泳分離來檢測擴增產物進行分析，由于平臺效應的存在，定量的準確性受到影響，且操作過程中還容易交叉污染，產生假陽性。1996年美國Applied Biosystems推出了實時熒光定量PCR技術，它不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，RQ-PCR具有簡便易行、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，而且也有效解決了常規(guī)PCR假陽性率高等缺點[2]。在診斷中，有時不能獲得足夠的待測樣品體積而限制了PCR技術的應用，而多重熒光定量PCR的出現很好地解決了這一難題，該技術能在同一PCR反應體系中實現多種病原體或基因的同步檢測，大大縮短了檢測時間，節(jié)省了試劑的用量。

1 多重熒光定量PCR技術的概述

多重熒光定量PCR技術是在熒光定量PCR 的基礎上，利用兩對或兩對以上的引物以及相應的探針，實現在同一個反應體系中完成多個目標序列同時進行檢測[3]。而實時熒光定量PCR技術根據使用的熒光物質的不同可分為熒光染料和熒光探針兩類。熒光染料是一種擴增序列非特異性的檢測方法，而熒光探針是在常規(guī)PCR基礎上運用熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技術，加入熒光標記探針，巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起，在PCR指數擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量[4]。

2 多重熒光定量PCR技術的分類

多重熒光定量PCR分為熒光染料和熒光探針。染料法是熒光定量PCR最早使用的方法。染料能結合在DNA雙鏈上，在激發(fā)光源的照射下發(fā)出熒光信號。隨著反應的進行PCR產物不斷增加，因此染料結合在PCR產物上的量也會越多。而探針式則是通過與靶序列特異性雜交的探針來指示擴增產物的增加。

2.1 熒光探針

探針式熒光檢測技術是利用熒光共振能量轉移原理來設計探針，在探針5′端標記一個熒光報告基團(Reporter，R)，3′端標記一個淬滅基團(Quencher，Q)，二者可以構成能量傳遞。當R基團與Q基團距離較近時，Q基團可以吸收或抑制R基團發(fā)出的熒光；當R基團和Q基團相距較遠時，Q基團則不能再吸收或抑制R 基團所發(fā)出的熒光，這時R基團的熒光釋放出來，熒光信號增強。常用的有TaqMan探針、分子信標、雙雜交探針、復合探針等[5]。

2.2 熒光染料

熒光染料也稱為DNA結合染色。該方法是利用染料無法與單鏈DNA結合而可以與雙鏈DNA結合并在結合時發(fā)出熒光信號，而在游離狀態(tài)下則不發(fā)出熒光信號[6]的原理實現的。因此可以用熒光信號強度來代表雙鏈DNA的數量，進而來計算PCR的擴增產物量。目前主要使用的是SYBR Green Ⅰ。但由于SYBR Green Ⅰ對PCR有一定的抑制性，且存在熒光強度低，穩(wěn)定性差的問題，近年來出現了一些性能改進的染料，如SYBR Green ER、Power SYBR、Eva Green TM等[7]。

3 不同熒光探針及SYBR Green Ⅰ熒光染料的優(yōu)缺點

不同熒光探針及SYBR Green Ⅰ熒光染料的分類情況、優(yōu)缺點對比及在實踐中的應用概況如表1所示[8-13]。

4 多重熒光PCR技術在動物檢測中的應用

4.1 在動物性食品衛(wèi)生中的應用

（1）肉、蛋、奶等畜產品常常會被各種病原菌污染而引起相應的食源性疾病，因此快速檢測食品中的病原菌是及時有效預防疾病傳播及食物中毒的重要前提，多重熒光PCR技術即可同時檢測多種病原細菌。（2）邵彪[14]等建立了同時檢測食品中多種細菌的多重熒光PCR快速檢測方法，該方法與單重體系具有很好的一致性。索原杰[15]建立了一套可以適用于不同實際情況中的牛奶致病菌檢測的多重實時熒光PCR檢測方法，并探究了乳酸菌對致病菌的生長抑制作用，該研究能為牛奶中主要致病菌的檢測提供一定的技術指導。

表1 不同熒光探針及SYBR Green Ⅰ熒光染料的優(yōu)缺點及其應用

4.2 在微生物檢測中的應用

4.2.1 細菌病診斷 （1）腸產毒素大腸埃希菌是一種引起人類和動物細菌性痢疾和細菌性食物中毒的常見腸道致病菌，嚴重危害人類健康和牲畜的安全，常見病原菌的檢驗方法存在著檢測周期長、工作量大、 所需試劑多，而且假陰性率高，靈敏度低，或假陽性率高，特異性差等缺點。夏燦[16]等根據GenBank公布的大腸桿菌O157：H7 的菌體抗原基因rfbE、鞭毛抗原基因fliC、溶血素基因hlyA、緊密黏附素基因eaeA和志賀樣毒素基因stx1和stx2的序列，建立了2個能夠快速、特異性地檢測大腸桿菌O157：H7及其4個主要毒力基因的三重熒光定量PC R方法。該試驗建立的三重熒光定量PCR 方法的敏感性、重復性及特異性均較好，可作為同時快速檢測腸出血性大腸桿菌O157：H7及其毒力基因的方法。這種快速、簡便、準確、特異的檢測方法是一種理想的檢測多種致病菌檢測方法，應用前景廣闊。（2）邢進[17]建立了一種同時檢測實驗動物中的流感嗜血桿菌、溶血嗜血桿菌和多殺巴斯德桿菌多重實時熒光定量PCR(qPCR)檢測方法。分別根據三種病原菌的Hpd基因和KMT1基因設計特異性引物和Taqman探針，經特異性、敏感性和重復性驗證，建立多重qPCR檢測方法，并對822份實驗動物呼吸道樣本進行檢測應用。結果所建立的多重qPCR方法與其他29種病原菌間無交叉反應，對三種病原菌的檢測限可達到10個拷貝/ul。（3）隨著海產品和魚類產業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大和集約化程度的不斷提高，各類水產病害接踵而至，已成為制約海產品產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。劉智超[18]建立了養(yǎng)殖大菱鲆中4種致病菌多重PCR和熒光定量PCR檢測方法。多重PCR可在一次PCR反應中完成4種病菌的定性檢測，而熒光定量PCR可對相應致病菌進行定量檢測，定性與定量相結合，又相互驗證，對大菱鲆這4種常見致病菌檢測能達到準確快速定量的目的，這將為大菱鲆疾病的防控和健康養(yǎng)殖提供強有力的技術支撐。（4）李濤[19]等人建立的海產品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌三重熒光定量PCR檢測試劑盒同樣適合于海產品等產品中三種致病菌的快速篩檢。除此之外，多重熒光定量PCR還可用來檢測水產動物源細菌磺胺類耐藥基因。

4.2.2 病毒病診斷 （1）王蓉蓉[20]等人根據GenBank中豬鏈球菌2型三種毒力因子CP2SJ、MRP、EF基因序列，建立了一種基于Taqman探針法的三重熒光定量PCR，可同時檢測上述三種毒力基因。該方法靈敏度高，CP2SJ、MRP、EF的最低檢測限分別為90、40、60拷貝數/μl的質粒；特異性強，與其他病原菌無交叉反應；重復性好，變異系數均小于3%。整個檢測擴增在60 min內完成。饒品彬[21]成功建立了六種豬病毒Eva Green多重實時熒光PCR方法，可以對這六種豬病毒進行快速準確地檢測和鑒定。劉高鵬[22]分別建立了針對該5種腹瀉病毒的普通多重PCR和EvaGreen多重實時熒光定量PCR方法并應用于臨床樣品檢測。所建立的多重實時熒光定量PCR方法可較好地用于臨床樣品5種腹瀉病毒檢測。（2）犬細小病毒(CPV)是一種存在于家養(yǎng)犬并在世界范圍內流行的重要病原體，其主要抗原類型為CPV-2及其變體CPV-2A、2B和2C，Yaru Sun[23]等人建立了一種多重TaqMan實時PCR方法，用于檢測和鑒別四種抗原類型。他們分別設計了兩組引物和探針，用這些引物和探針來進行多重TaqMan實時PCR檢測。通過兩個獨立的實時PCR，有效區(qū)分CPV-2、2A、2B和2C，且無交叉反應性。PCR與DNA測序有100%的一致性，提供了同時檢測的靈敏檢測方法和鑒別CPV病毒的四種抗原類型，并將該方法用于CPVS病毒的定量檢測基因組。（3）宋爽[24]等以牛羊常發(fā)病為研究對象，建立了PPRV、BTV、CPV單重、多重PCR方法和單重、多重熒光定量PCR方法，能夠準確的對這幾種牛羊常見病進行快速的檢測，具有較強的應用價值。

4.3 飼料中動物源性成分的檢測

（1）劉艷艷[25]等人為了快速鑒別飼料中的狐貍、水貂、貉子和狗源性成分，根據線粒體16S rDNA種間保守序列，設計合成針對狐貍、水貂、貉子和狗的特異性引物和探針，通過對熒光PCR反應體系和反應條件的優(yōu)化篩選，建立了多重實時熒光PCR方法，在同一PCR反應體系中可以同時完成4種動物源性成分檢測。該方法特異性強，靈敏度高，狐貍、水貂、貉子和狗的DNA檢出限為0.01ng。結果表明，該方法可以有效地鑒別出飼料中狐貍、水貂、貉子和狗源性成分，同時適用于相關動物產品中。（2）付理文[26]等人建立了一種可同時檢測豬、牛、羊、雞、鴨、鵝6種動物源性成分的六重實時熒光定量PCR方法。應用此方法分別對18種不同源性動物DNA和200份不同來源樣品進行豬、牛、羊、雞、鴨、鵝源性成分檢測。結果表明，所建立的六重實時熒光PCR方法靈敏度高，對六種動物的最低核酸檢測量分別為0.049ng、0.048ng、0.085ng、0.13ng、0.162ng、0.074ng(50μl體系)；特異性強，對狗、兔、鼠、驢、馬、駱駝等其他12種動物無特異性擴增；200份樣品的檢測結果表明六重qPCR檢測方法敏感，同一反應體系下實現一次對6種動物快速定量檢測，耗時短、效率高、適用性廣。（3）高靈敏度和定量的無公害豬肉鑒別工具的研制重要的是認證加工肉制品，特別是在清真產品的情況下。定量方法是區(qū)分故意摻假與交叉污染的關鍵。Joana S. Amaral[27]等人開發(fā)和驗證了一種新的特異性和高靈敏度的EVRAGEN實時性PCR系統(tǒng)。肉制品中豬肉定量PCR系統(tǒng)的研究基于標準化的分析DCT方法被成功地開發(fā)和優(yōu)化，并應用于豬肉的檢測和定量，其值分別為0.0001%和0.01%(W/W)。該方法具有真實性、精確性和重復性。在檢測樣品中，40%的清真產品檢測出豬肉，與標簽不一致。（4）Mi-ju Kim[28]等人開發(fā)了一種基于TaqMan?探針的快速雙重RTPCR檢測法。該方法能在40min內的同時檢測雞肉和鴿肉的線粒體細胞色素b基因，二者的絕對檢出限均為0.1pG。從生的或熱處理的肉中提取的DNA，可以檢測到0.01%只鴿子DNA。，以及相反的雞的DNA。該方法可作為一種鑒別生肉和熟肉制品中鴿肉和雞肉的快速、靈敏、特異的檢測方法。

4.4 抗性基因檢測

抗生素的廣泛使用導致了耐藥性微生物的增多，對抗性基因的快速檢測能有效控制疾病的發(fā)展，及時調整治療方案。黃國秋[29]等人根據Gen Bank中細菌磺胺類耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3的保守序列設計3對特異性引物及相應Taq Man探針，以重組質粒標準品為模板對反應條件進行優(yōu)化，建立一種可同時檢測上述3種耐藥基因的三重熒光定量PCR方法，并對該方法進行敏感性、特異性、重復性及臨床菌株檢測試驗。結果表明：該方法定量范圍為1×10～1～1×10～8拷貝/反應時，其標準曲線呈良好的線性關系；該方法靈敏度高(3個基因的最低質粒檢測限均可達到10拷貝/反應)、特異性強(與其他病原菌及病毒無交叉反應)、重復性好(變異系數均小于2%)；對臨床菌株的檢測結果與藥敏試驗結果的符合率達94.2%，且整個檢測過程可在2h內完成。所建立的可同時檢測Sul1、Sul2和Sul3基因的三重熒光定量PCR方法可用于臨床檢測細菌的磺胺類耐藥基因。

4.5 腫瘤早期診斷

DNA甲基化作為表觀遺傳學的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術是甲基化研究及臨床檢測所必需的。陳曉云[30]提出了改良多重實時熒光定量PCR技術，并利用該技術檢測64份大腸癌標本及其正常對照的CpG島甲基化表型。

5 多重熒光PCR技術的前景和不足

多重PCR技術與實時熒光定量PCR的結合，拓寬了其應用范圍，打破了傳統(tǒng)的科學術語，實時熒光定量PCR通常用于描述應用多個寡核苷酸探針區(qū)分多個擴增子的情況，但由于可獲得的熒光基因種類有限，導致這種方法的應用是有一定難度的，另外實時熒光定量PCR需要專門的儀器設備，檢測所用的高特異的探針合成成本高，同時，外源DNA的干擾、引物探針含量及其特異性都可能影響檢測結果。因此，如何簡化樣品處理過程、使檢測標準化、降低檢測的成本是多重實時熒光定量PCR技術在應用于動物方面中需要改進的方面。